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浅析广东省首例新型冠状病毒的分离情况与鉴定情况

2020-03-06 618 上传者：管理员

摘要：2020年1月，在广东省陆续从湖北省武汉市输入多例疑似新冠状病毒（SARS⁃CoV⁃2）感染的病例，经检测为SARS⁃CoV⁃2核酸阳性的实验室确诊病例。为加快了解SARS⁃CoV⁃2毒力，满足药物研发和疫情防控等需求，并建立SARS⁃CoV⁃2分离方法为后续研究打下基础，本研究使用Vero⁃E6细胞，选择一例经Real⁃timeRT⁃PCR鉴定为SARS⁃CoV⁃2阳性的肺泡灌洗液进行接种，逐日观察，肺泡灌洗液接种的细胞管4d出现疑似细胞病变，再进行第二代接种2d出现病变，提取核酸进行鉴定，为SARS⁃CoV⁃2阳性。经二代测序成功获得全基因组序列，进化分析结果显示本次分离的毒株为SARS⁃CoV⁃2。

关键词：
分离
感染
新型冠状病毒
鉴定
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2019年12月，中国湖北省武汉市暴发不明原因肺炎。中国学者经高通量测序、分离培养、电镜观察等方法进行分析后，2020年1月9日宣布本次不明原因的病毒性肺炎病例的病原体为新型冠状病毒。2020年1月12日，世界卫生组织正式宣布将造成武汉肺炎疫情的病毒命名为：2019年新型冠状病毒［1］。2020年2月国际病毒分类委员会的冠状病毒研究小组发布新命名，正式将新型冠状病毒从“2019⁃nCoV”更名为“SARS⁃CoV⁃2”［2］。新型冠状病毒（SARS⁃CoV⁃2）属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60～140nm。其基因特征与SARS⁃CoV和MERS⁃CoV有明显区别。目前研究显示与蝙蝠SARS样冠状病毒（bat⁃SL⁃CoVZC45）同源性达85以上。体外分离培养时，2019⁃nCoV96h左右即可在人呼吸道上皮细胞内发现，而在Vero⁃E6和Huh⁃7细胞系中分离培养需约6d［3］。2020年1月，广东省深圳市一具有疑似SARS⁃CoV⁃2感染的临床症状、经实验室诊断鉴定为SARS⁃CoV⁃2阳性的病例，经调查发病前2周有武汉旅行史，无华南海鲜批发市场接触史。患者发病后病情危重，取肺泡灌洗液进行实验室诊断，核酸检测结果显示强阳性，提示病毒载量比较高，为进一步研究该病毒，本研究利用Vero⁃E6细胞对新型冠状病毒进行分离，为后续的病毒分离、疫苗筛选和药物分析打下基础。

一、材料与方法

1 标本来源

编号20SF014的标本取自一名有武汉旅行史的疑似SARS⁃CoV⁃2感染者的肺泡灌洗液。该病例于2020年1月8日出现疑似SARS⁃CoV⁃2感染的临床症状，1月9日于社区医院初诊，后病情加重转诊于深圳市北大医院，1月14日经深圳市疾控中心初检和广东省疾控中心复核，实验室诊断为SARS⁃CoV⁃2核酸阳性。

2 细胞系和主要试剂

Vero⁃E6细胞为广东省疾病预防控制中心病原微生物检验所虫媒病毒实验室保存，MEM培养液、胎牛血清以及双抗均购自Gibico公司。

3 病毒分离

将肺泡灌洗液标本按照细胞培养液总体积10接种单层Vero⁃E6细胞管，置于5%CO2的37℃恒温培养箱孵育2h。孵育结束加入1ml的2%胎牛血清的MEM细胞维持液，置于5 CO2的37℃恒温培养箱培养，同时设置阴性对照。逐日观察细胞病变（Cytopathiceffect，CPE）情况，出现CPE达75以上收毒，反复冻融3次后离心收集上清保存于－80℃。

4 Real⁃timeRT⁃PCR鉴定

将反复冻融3次的细胞上清按照病毒RNA提取试剂盒操作步骤提取，病毒RNA提取试剂盒购自美国LifeTech公司，Real⁃timeRT⁃PCR试剂盒购自上海伯杰公司。

5 病毒滴度TCID50测定

Vero⁃E6细胞传代以后以1.5×104个/孔接种于96孔板内，每孔加50μl含有10 FBS的MEM培养基，培养24h，准备8个1.5mlEP管，于管内对从－80℃冰箱取出的病毒种子液做连续10倍稀释，即从稀释10倍至108倍，分别标记为10⁃1～10⁃8，依次加入已铺满单层Vero⁃E6细胞的96孔板内，每组设10个复孔，2个正常对照孔，每日观察CPE，待CPE现象稳定后根据Reed⁃muench法进行TCID50的计算。

6 病毒电镜观察

在BSL⁃3实验室内，病毒培养上清使用4多聚甲醛室温灭活1h后转入BSL⁃2实验室中进行透射电镜负染制样。将3μl灭活后的病毒培养上清液滴在亲水化处理过的碳膜铜网上，室温吸附1min；滤纸吸去多余液体后，在铜网上滴加3μl2磷钨酸溶液染色1min，滤纸吸干，晾干后置于TecnaiG2F20TWIN透射电镜中观察病毒颗粒，加速电压120Kv，放大倍数22000～62000倍。

7 文库构建和二代测序

使用Qubit4.0将双链cDNA准确定量后，稀释成0.2ng/μL。取5μl作为测序模板，按照NexteraXTDNASamplePreparationKit试剂盒说明构建测序。采用高通量测序技术对分离株20SF014进行全基因组测序，将获得的序列跟GenBank上公开的SARS⁃CoV⁃2全基因组序列进行比对，比对序列见表1。

表1 用于全基因组序列分析的新型冠状病毒（SARS⁃CoV⁃2）序列

二、结果

1 病毒的分离及滴度测定

将处理过的标本接种Vero⁃E6细胞，成功分离到病毒，编号为20SF014毒株。接种病人肺泡灌洗液的Vero⁃E6细胞与正常对照（图1A）比较，第一代在4d开始出现CPE（图1B、1C、1D），细胞肿胀，细胞间隙变宽，细胞间连接消失，出现多核巨细胞，细胞折光性增强，部分细胞漂浮。分离株的第三代细胞培养物按照Reed⁃Muench法计算病毒的TCID50在104.5/0.05mL～104.9/0.05mL之间。

2 Real⁃timeRT⁃PCR鉴定

将第二代细胞培养物进行核酸提取，经过Real⁃timeRT⁃PCR双靶标ORF1ab和N基因试剂盒检测，两个靶标均可获得S型扩增曲线，结果显示SARS⁃CoV⁃2核酸阳性，Ct值约为12个循环。

3 病毒电镜分析

将第二代细胞培养物进行透射电镜负染并观察，置于TecnaiG2F20TWIN透射电镜中观察病毒颗粒，加速电压120Kv，放大倍数22000～62000倍，可观察到病毒颗粒和病毒形态（图2A、2B），直径约60～140nm，呈圆形或椭圆形，病毒颗粒有明显的棘突。

图2 新型冠状病毒（SARS⁃CoV⁃2）透射电镜观察图

4 分离株基因组序列同源性分析

分离毒株经高通量测序获得数据，采用CLCGenomicsworkbench（CLCBio）对数据进行拼接。20SF014病毒全基因组全长29881bp，与GenBank数据库公布的全部新型冠状病毒序列以及同源性较高的冠状病毒序列进行比对（图3），与2019⁃nCoV同源性为100，确定本次用Vero⁃E6分离到的毒株为新型冠状病毒毒株。

图3 新型冠状病毒（SARS⁃CoV⁃2）全基因组系统发生树

三、讨论

本研究从1份肺泡灌洗液中成功分离到1株新型冠状病毒，经细胞培养、电镜观察和分子生物学鉴定，分离的病毒为新型冠状病毒（SARS⁃CoV⁃2）。通过细胞培养分离病毒，因操作简单、成本低和获得的病毒量大等优点而被广泛应用。在本研究中，发现SARS⁃CoV⁃2对Vero⁃E6细胞系敏感，经Real⁃timePCR检测为强阳性的标本，在4～5d可出疑似病变，再经第二代细胞接种，可很快出现典型的细胞病变，并可获得较高的滴度。

新型冠状病毒的成功分离，为即将开展的新型冠状病毒疫苗研制、抗病毒药物的筛选以及快速检测试剂的研发奠定了坚实的基础。

参考文献：

[1]国家卫健委《.新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(第四版)》.

张欢,郑焕英,邹丽容,刘哲,梁丽君,彭晓放,张薇,柯昌文,武婕.广东省首例新型冠状病毒的分离与鉴定[J/OL].病毒学报:1-5[2020-03-06].