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基于分子对接及分子动力学模拟预测青黛在新型冠状病毒肺炎中的干预作用

2020-04-24 683 上传者：管理员

摘要：目的：探究基于分子对接及分子动力学模拟预测青黛在新型冠状病毒肺炎中的干预作用。方法：从蛋白晶体结构数据库、中医药资料库获取受体晶体结构、配体小分子2D结构。采用AutodockVina1.1.2程序进行分子对接，初步分析结合情况，并获得最佳构象。应用AmberTools18.0软件进行分子动力学模拟，完成自由能计算、氢键分析等，进一步验证结合模式。结果：数据结果显示靛蓝、靛玉红能与2019-nCoV/ACE2复合物结合，且两个体系具有相似的结合模式。结论：本研究预测可通过青黛干预2019-nCoV/ACE2复合物对新型冠状病毒肺炎起到明显的治疗作用。

关键词：
分子动力学模拟
新型冠状病毒肺炎
青黛
靛玉红
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2019年年底爆发的新型冠状病毒肺炎已成为一种全球性流行病，严重危害着人类健康。2020年1月12日，世界卫生组织将引起该病的病毒命名为“2019新型冠状病毒”[1]。2020年2月11日，WHO将该病毒命名为“SARS-CoV-2”，将该病毒引起的肺炎命名为“COVID-19”[2]。研究报道，血管紧张素转换酶Ⅱ(ACE2)是引起该病严重流行的新型冠状病毒的细胞受体[3]。虽然新型冠状病毒肺炎死亡率并不显著高于一般病毒性肺炎，但其人传人、无症状携带者即可传播的特点，使疫情在全球范围内迅速蔓延[4]。因此，寻找副作用小、特异性高的防治药物迫在眉捷。

青黛在中医临床上的应用可追溯到2000余年前。《中国药典》记载青黛的主要有效成分是靛蓝和靛玉红[5]。现代研究表明，青黛具有抗炎、抗菌、抗病毒、调节免疫、抗肿瘤等多种药理活性[6]。有实验研究报道，靛蓝可通过下调IL-6的表达起到一定的体外抗炎作用[7]。靛玉红可通过调节MAVS通路发挥抗病毒作用，有下调炎症因子表达、减轻病毒继发性肺炎等药理作用[8]。签于此，本研究基于分子对接技术及分子动力学模拟预测青黛的两个主要有效成分靛蓝、靛玉红与2019-nCoV/ACE2复合物的结合模式，推测对新型冠状病毒肺炎的干预作用，为新药的开发和临床治疗提供参考。

1、材料与方法

1.1 分子对接阶段

选取蛋白晶体结构数据库的2019-nCoV/ACE2复合结构为受体。利用Pymol程序，删除复合物中的结晶水和其他小分子，加氢后保存为pdb格式。将该结构文件载入AutodockTool1.5.6程序，添加原子电荷，分配原子类型，保存为pdbqt格式，作为对接受体。从中医药资料库中获取靛蓝、靛玉红结构。将小分子mol2格式文件载入AutodockTool1.5.6，加原子电荷，分配原子类型，所有可旋转键均设为柔性，保存为pdbqt格式，作为对接配体。

采用AutodockVina1.1.2[9]将配体小分子对接到2019-nCoV/ACE2的活性位点。配体设置为柔性，受体刚性。搜寻精度exhaustiveness设为64；格点中心为x=-32.607，y=17.809，z=5.999；盒子大小为x=24，y=24，z=24；格点间距1Å；其他参数默认。应用AutoGrid计算格点能量，对接运算采用拉马克遗传算法。

1.2 分子动力学模拟阶段

将分子对接阶段的最佳构象作为进一步分子动力学模拟的初始结构。用AmberTools18.0软件包[10]完成所有的分子动力学模拟。受体使用ff14SB力场[11]，配体小分子使用gaff力场[12]。在tleap模块中，将蛋白-小分子复合物置于一个截断的八面体盒子中，添加TIP3P模型的水分子，且使得蛋白中的原子距离水盒子边缘最小距离为10Å。添加拮抗离子以中和系统电荷。逐步进行能源最小化、加热、平衡、动力学采样等。首先采用5000步最速下降法，然后采用5000步共轭梯度法进行能量最小化。然后将系统置于NVT系综，使用Berendsen-coupling算法，以50ps从0k加热到300k。加热完成后，在NPT条件下(恒压P为1.013×105Pa)，使用Langevin-dynamics算法，体系平衡50ps。接下来，在具有周期性边界条件的NPT下进行了50ns的分子动力学模拟。将模拟时间步长设置为2fs，利用SHAKE算法限制与氢原子相连的键。非键作用截断值设为10.0Å。采用MM/GBSA方法计算受体-配体结合自由能，用CPPTRAJ模块完成轨迹数据分析。

2、结果

2.1 分子对接结果分析

通过分子对接技术，可知靛蓝与2019-nCoV/ACE2对接的自由能最低值为-7.3kcal/mol；靛玉红与2019-nCoV/ACE2对接的自由能最低佳为-8.1kcal/mol；并且获得对接最佳构象。如图1。注：a靛蓝与2019-nCoV/ACE2对接最佳构象；b靛玉红与2019-nCoV/ACE2对接最佳构象。

图1 对接最佳构象示意图

靛蓝与2019-nCoV/ACE2对接形成2个氢键，与配体形成氢键的残基是Arg403(E)、Glu37(A)，键长（重原子间距离）分别为2.92Å、2.80Å；配体与Tyr495（E）、Tyr453（E）可形成疏水堆积。靛玉红与2019-nCoV/ACE2形成3个氢键；残基Arg403(E)与配体形成2个氢键，键长为3.01Å、2086Å；残基Glu37(A)与配体形成1个氢键，键长为2.77Å；配体与残基Tyr495（E）、Tyr453（E）、Phe390（A）可形成疏水堆积。二者均不存在pi-pi堆积。注：a为靛蓝与2019-nCoV/ACE2对接模式分析；b为靛玉红与2019-nCoV/ACE2对接模式分析；E代表E链，即病毒蛋白。A代表A链，即ACE2。

图2 配体与受体对接模式分析

2.2 分子动力学模拟结果分析

应用分子动力学模拟验证了小分子可以结合到受体复合物的活性位点。如图3、图4。

图3 靛蓝与2019-nCoV/ACE2结合囊结构图

图4 靛玉红与2019-nCoV/ACE2结合囊结构图

靛蓝和受体复合物模拟结合时总结合自由能为-18.1836kcal/mol，其中气相自由能为-40.5104kcal/mol，溶剂化自由能为22.3268kcal/mol。对结合过程起促进作用的有:范德华作用力-29.7369kcal/mol，静电相互作用-10.7735kcal/mol，非极性溶剂化能-3.5791kcal/mol。对结合过程起抑制作用的是极性溶剂化能25.9060kcal/mol。靛玉红和受体复合物模拟结合时总结合自由能为-16.5408kcal/mol，其中气相自由能为-63.0685kcal/mol，溶剂化自由能为46.5276kcal/mol。对结合过程起促进作用的有:范德华作用力-21.8212kcal/mol，静电相互作用-41.2473kcal/mol，非极性溶剂化能-3.3194kcal/mol。对结合过程起抑制作用的是极性溶剂化能49.8470kcal/mol。可见，靛蓝与受体复合物结合过程中，范德华作用对体系结合的贡献要大于静电作用、非极性溶剂化能；靛玉红与受体结合过程中，静电作用对体系结合的贡献要大于范德华力、非极性溶剂化能。见表1。

表1 结合自由能分析

靛蓝的整个分子动力学模拟过程中共形成11个氢键，靛蓝与受体复合物结合囊区域残基ARG_375、GLU_19形成2个主要氢键,占比分别为21.96%、12.68%，形成靛蓝与受体复合物结合的主要原因。靛玉红的整个分子动力学模拟过程中共形成19个氢键，靛蓝与受体复合物结合囊区域残基ASP_12、HIE_16形成2个主要氢键,占比分别为59.46%、24.66%，形成靛玉红与受体复合物结合的主要原因。见表2、表3。

表2 靛蓝与2019-nCoV/ACE2的氢键相互作用

表3 靛玉红与2019-nCoV/ACE2的氢键相互作用

3、讨论

分子对接结果表明配体小分子（靛蓝、靛玉红）与2019-nCoV/ACE2的活性位点残基之间形成氢键、疏水作用，并得到了结合最佳构象。由于分子对接技术体现的是配体与受体的静态作用，因此进一步完成了分子动力学模拟验证配体与受体复合物的结合情况。采用AmberTools18.0模拟了50ns的分子动力学。分子动力学模拟平衡后，用MM/PBSA计算各配合物的总自由能。自由能计算和氢键分析可以很好地阐明小分子配体与2019-nCoV/ACE2之间的结合模式。结果表明，这两个体系的主要作用力是静电相互作用、范德华力，以及非极性溶剂化自由能。在靛蓝的分子动力学模拟过程中观察到范德华力的绝对值大于非极性溶剂化相互作用和静电相互作用的绝对值。可见，范德华力在靛蓝与2019-nCoV/ACE2的相互作用中起着重要作用，有利于配体与受体的结合。在靛玉红的分子动力学模拟过程中观察到静电作用的绝对值远大于非极性溶剂化相互作用和范德华相互作用的绝对值。可见，静电作用在靛玉红与2019-nCoV/ACE2的结合过程中起着关键作用。非极性溶剂化自由能和极性溶剂化自由能是溶剂化自由能的两个组成部分。非极性溶剂化能与溶剂的可极化面积有关，在两个体系中均为负，但均小于范德华力、静电作用。非溶剂化自由能可以轻微促进小分子与受体的结合。然而，在两个体系中极性溶剂化的自由能阻碍了小分子和2019-nCoV/ACE2之间的相互作用。靛蓝与2019-nCoV/ACE2总结合自由能为-18.1836kcal/mol，靛玉红为-16.5408kcal/mol。相比较而言，可能靛蓝的结合力较靛玉红更大。

所有氢键的形成也是这些复合物结合过程中的一个重要因素。两个体系形成的氢键均为配体中的含氮、含氧基团与ACE2蛋白残基之间的氢键，表明配体的含氮和含氧基团、ACE2蛋白活性残基为形成氢键的关键部分。

中药治疗作用存在多靶点、多环节、整体调节的特点[13]，在治疗发病机制复杂的传染性疾病中发挥着独特作用。在新型冠状病毒肺炎的防治中，国家卫生健康委员会在不断更新的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》中也强调了中医药的应用,提出病因为感受“疫戾”之气。从“试行第三版”开始明确提出中医药的具体治疗方案及具体药物[14]。《中国药典》记载青黛有清热解毒，凉血消斑，泻火定惊之功；用于温毒发斑、血热吐衄、胸痛咳血、口疮、痄腮、喉痹、小儿惊痫[5]。中医认为引起新型冠状病毒肺炎“疫戾”之气可归属于温热毒邪范畴。中医古籍有青黛治疗温毒的相关记载。《神农本草经》记载青黛“味苦寒，主解诸毒”。《本草纲目》记载“青黛一两、杏仁二两，主治肺热咯血”。《本经逢原》云“青黛，泻肝胆，散郁火，治温毒发斑及产后热痢下重”。《要药分剂》云“除热解毒，兼能凉血”。《开宝本草》记载“主解诸药毒，小儿诸热，惊痫发热，天行头痛寒热，煎水研服之”。现代多项研究表明，青黛作为复方组分或单独应用可用于腮腺炎病毒感染[15]、人乳头状病毒感染[16]、带状疱疹病毒感染[17]、流感病毒感染[18]等疾病。

综上所述，数据结果显示青黛的两种主要有效成分靛蓝、靛玉红可与2019-nCoV/ACE2结合，且两个体系具有相似的结合模式。结合历代医家青黛临床应用经验，本研究预测青黛可通过干预2019-nCoV/ACE2复合物对新型冠状病毒肺炎起治疗作用。然而，单从分子对接、分子动力学模拟探讨青黛对新型冠状病毒肺炎的治疗作用是不够的。其作用机制还需要设计严格的动物实验及临床实验进一步验证。

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