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探究在新型冠状病毒肺炎中银翘解毒软胶囊治疗的作用机制

2020-04-28 615 上传者：管理员

摘要：目的：探究并分析在新型冠状病毒肺炎中银翘解毒软胶囊治疗的作用机制。方法：将银翘解毒软胶囊所含1418个化合物与48个COVID-19炎症相关靶蛋白进行分子对接，构建药物-靶蛋白网络图，阐明银翘解毒软胶囊的关键活性成分和潜在作用靶点。结果：通过网络分析获得银翘解毒软胶囊的活性成分有50个，主要为黄酮类和三萜类化合物；潜在作用靶点37个，主要为MTOR、JAK3、ACE、ACE2、PIK3CA、TNF、AKT2和MAP2K1等炎症靶点。分子对接结果显示连翘酯苷及牡荆素-2″-O-鼠李糖苷与新型冠状病毒（SARS-CoV-2）3CL水解酶具有较好的亲和力，甘草酸与ACE2酶具有较好的亲和力。结论：银翘解毒软胶囊是通过干扰SARS-CoV-2病毒复制、调节炎症信号通路表达及炎症因子分泌从而有效发挥治疗COVID-19的作用。

关键词：
作用机制
新型冠状病毒肺炎
活性成分
网络药理学
银翘解毒软胶囊
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2019年12月以来，新型冠状病毒肺炎（COVID-19）陆续在全球100多个国家爆发。COVID-19传染性强，潜伏期久，人群普遍易感，截止3月30日，全球新冠累计确诊超71万例，死亡33630例。该疾病主要临床表现为发热、咳嗽、气促和呼吸困难等，严重者可导致严重的急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征，多器官功能衰竭，甚至死亡。在治疗中发现，部分新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染者前期病症较轻，但后期突然加重，甚至出现死亡。Huang等[1]对武汉金银潭医院的41例COVID-19感染患者的临床研究发现，重症患者血浆中白介素-2（IL-2）、白介素-7（IL-7）、白介素-10（IL-10）、粒细胞集落刺激因子（G-SCF）、趋化因子10（IP-10）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、巨噬细胞炎症蛋白-1α（MIP-1A）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）显著高于非重症患者，提示疾病的严重程度与“细胞因子风暴”密切相关。细胞因子风暴又称炎症因子风暴，是指炎症因子在体内的不受调控的过度释放。细胞因子风暴发生时，免疫细胞过度活化和促炎性细胞因子大量释放，因此抑制细胞因子的产生对治疗COVID-19至关重要[2]。

SARS-CoV-23CL水解酶，又称主要蛋白酶（Mpro）是冠状病毒复制中的关键酶，且具有高度的保守性。血管紧张素转化酶2（ACE2）是SARS-CoV-2的宿主细胞受体，SARS-CoV-2通过刺突糖蛋白（S蛋白）与人体的ACE2结合从而入侵机体致病，这两个靶蛋白对于病毒复制至关重要，是非常有前景的抗病毒药物靶标[3-4]。

中药自古以来在防治“疫病”等烈性传染病的过程中发挥了重要的作用，以复方应用为主，特点为多成分、多靶点协同发挥作用，同时具有广谱抗菌、抗病毒、调节免疫功能的整体综合调节作用[5-6]。在这次新冠病毒肺炎疫情中，大量中药方剂应用于临床，显示出了明确的疗效[7]。国家卫健委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第三版）》已经将银翘散等纳入COVID-19治疗方案中[8]。

银翘解毒软胶囊原方来源于清代吴鞠通《温病条辨》中的银翘散，主要由金银花、连翘、薄荷、荆芥、淡豆豉、牛蒡子（炒）、桔梗、淡竹叶、甘草9味药制成，具有疏风解表、清热解毒之功效。临床上用于治疗流行性感冒、急性扁桃体炎、咽喉炎、肺炎、疱疹、麻疹、流行性腮腺炎等病毒性疾病[9]。现代药理实验表明，银翘解毒软胶囊能明显改善流感病毒及呼吸道合胞病毒所致小鼠肺部炎症，降低炎症因子及相关蛋白的表达[10-11]。本实验旨在采用网络药理学的研究方法，收集银翘解毒软胶囊所含成分与新型冠状病毒肺炎相关炎症靶点，构建“中药-活性成分-靶点”相互作用网络，筛选关键作用靶点和活性成分群，并与病毒作用关键靶蛋白进行分子对接，为中医药治疗新冠肺炎提供一定的理论基础与科学依据。

1、材料与方法

1.1 银翘解毒软胶囊所含化学成分和作用靶点的收集

以金银花、连翘、薄荷、荆芥、淡豆豉、牛蒡子、桔梗、淡竹叶、甘草9味药材为检索词，在江苏康缘药业股份有限公司创建的中医药网络药理学智能信息平台数据库中检索银翘解毒软胶囊所含的化合物成分[12]。

通过在CNKI和Pubmed数据库中以“COVID-19”“SARS-CoV-2”为关键词检索，在DisGeNET和OMIM数据库搜索确定新型冠状病毒肺炎COVID-19炎症相关作用靶蛋白，并借助Uniprot数据库校正靶标蛋白对应的基因名[15]。

1.2 药材-成分-靶点网络构建

使用Discoverystudio2.5软件对靶蛋白结构进行修饰、加氢及自动分配原子类型和部分电荷，并根据靶蛋白复合物中配体的中心点坐标确定结合的活性中心，然后将处理过的靶蛋白和化合物导入AutoDock4.0进行半柔性分子对接。在TCMN数据库中抽取银翘解毒软胶囊中所含成分与新冠病毒肺炎靶点的分子对接数据，选取对接得分≥7的数据，导入Cytoscape3.2.1软件，构建药材-化合物靶点作用网络，并利用插件net workanalyzer分析网络特征[16]。

1.3 活性成分与靶点的分子对接

从RCSB-Protein-Data-Bank数据库下载SARS-CoV-23CL水解酶和ACE2的3D晶体结构。对蛋白进行结构处理和优化后，以与新冠病毒肺炎靶点对接得分≥7的化合物分子为配体，分别以SARS-CoV-23CL水解酶和ACE2为受体，根据靶蛋白复合物中配体的坐标以及靶蛋白活性口袋进行设置，采用Auto-Dock软件进行分子对接[17]。采用Discovery-Studio-Visua lizer软件对对接构象进行可视化分析，筛选打分较高且构象较好的结果作为分子对接结果。

2、结果

2.1 网络特征分析

在TCMN数据库中检索，共获得银翘解毒软胶囊的1418个化合物，将这些化合物与48个COVID-19炎症相关的靶蛋白（靶蛋白信息见表1）进行分子对接，构建药材-化合物-靶蛋白网络见图1。通过分析网络得到该网络的节点数为176个（4个药材，132个化合物及37个靶点），网络边数为362，网络中心度为0.537，网络密度为0.024，最短路径为29412。

表1 COVID-19炎症相关作用靶蛋白

图1 药物-靶蛋白网络

2.2 药物-靶点网络分析

一个节点的度值代表网络中与节点相连的节点的数量，介数反映了相应的节点在整个网络中的作用和影响力。度和介数较高的节点在整个网络中发挥枢纽的关键作用，可能是关键的靶蛋白或者重要成分[18]。通过分析网络中靶蛋白的度和介数发现，有73%的靶蛋白可与2个以上的化合物有相互作用（表2），其中作用大于10个化合物分子的靶点有8个，分别为MTOR、JAK3、ACE、ACE2、PIK3CA、TNF、AKT2、MAP2K1，提示这些可能是银翘解毒软胶囊治疗新型冠状病毒性肺炎的核心蛋白靶点。

表2 网络度较高的靶蛋白

从化合物的角度分析，有50个化合物分子可以作用于3个以上的靶点，这些化合物可能是银翘解毒软胶囊中的活性作用成分。度值大于5的化合物包括loniflavone、玉米黄二呋喃素、伪蒲公英甾醇、异甘草内酯、光甘草内酯、4′-甲基醚金连木黄酮、3β-乙酰基-20,25-环氧达马烷-24α-醇、desoxo-glabrolid-acetate、似梨木双黄酮、sigmasta-4,22-dien-3,6-dione、蒲公英甾醇11个（表3），这些化合物是银翘解毒软胶囊治疗COVID-19的关键成分。

表3 网络度较高的化合物

2.3 与M pro及ACE2的分子对接结果

将银翘解毒软胶囊的活性成分进行分子对接验证，结果显示与Mpro结合能力较强的化合物分子有3个，与ACE2的结合能力较强的化合物分子有11个。其中连翘酯苷与Mpro对接得分最高为−8.53，甘草酸与ACE2对接得分最高为−5.36。其中牡荆素-2″-O-鼠李糖苷对2种蛋白均有一定的结合能力，对接得分分别为−6.19和−2.82。分子对接模式见图2。进一步的体外实验结果证实，银翘解毒软胶囊对SARS-CoV-2感染VeroE6细胞致细胞病变具有抑制作用，半数抑制浓度为1.256mg/mL（以内容物计）。

图2 连翘酯苷、甘草酸及牡荆素-2″-O-鼠李糖苷分别与Mpro和ACE2的分子对接模式

3、讨论

COVID-19属于中医疫病范畴，病因为感受疫戾之气，病位在肺，基本病机特点为“湿、热、毒、瘀”[19]。中医药在辨证施治方面具有得天独厚的优势。本研究采用网络药理学方法，系统分析了银翘解毒软胶囊对新冠病毒肺炎COVID-19的潜在治疗机制。通过分析药靶网络特征发现，银翘解毒软胶囊中具有多分子、多靶点的作用特性。进一步分析网络中的靶蛋白，表明银翘解毒软胶囊可作用于MTOR、JAK3、ACE、ACE2、PIK3CA、TNF、AKT2、MAP2K1等炎症靶点，参与MTOR信号通路、Toll样受体信号通路、JAK-STAT信号通路、PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路及Th17细胞分化通路等。在COVID-19患者临床研究发现，重度患者与非重症患者血浆中IL-2、IL-7、IL-10、G-SCF、IP10、MCP1、MIP1A、TNFα、IL-6，IFN-γ均表现出明显差异，这些炎症因子涉及Toll样受体信号通路、TNF信号通路、Th17细胞分化通路、MAPK信号通路、JAK-STAT信号通路等。因此，银翘解毒软胶囊可能通过调控炎症、免疫相关通路，干扰炎症因子表达，发挥治疗重症和危重症COVID-19的作用。

综上所述，本研究应用网络药理学和分子对接的方法对银翘解毒软胶囊中化学成分、作用靶点以及与Mpro和ACE2结合能进行了探索性研究，体现了中药复方多成分、多靶点、多途径共同作用的特点，体外细胞实验也证实了银翘解毒软胶囊的抑制活性。后续实验可以围绕预测出的靶点和作用通路进行进一步的实验验证，为COVID-19的药物研发提供理论依据和研究方向。

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