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全自动核酸提纯及实时荧光PCR系统的性能验证与评价

2024-03-01 142 上传者：管理员

摘要：目的评估全自动核酸提取纯化及实时荧光PCR分析系统检测新型冠状病毒核酸的性能。方法根据新型冠状病毒感染防控方案，研究购自上海生工的全自动核酸提取纯化及实时荧光PCR分析系统、2019-nCoV试剂盒、不同浓度的新型冠状病毒核酸检测标准品，对样品的阴阳性符合率、精密性、变异系数、最低检出限、重复性、检测时长等指标进行检测，并根据检测结果验证、评估自动核酸提取纯化及实时荧光PCR分析系统性能。结果样本的阴、阳性符合率均为100.00%,精密性阳性符合率均为100.00%,变异系数(coefficient of variation,CV)为≤5.00%,最低检出限循环阈值(cycle threshold, Ct)<43.00,阳性检出率为100.00%,重复性阴、阳性符合率均为100.00%,设备检测时长2h以内。结论根据本研究结果，该系统特异性强、重复性好，同时最低检出限和精密性均符合现场使用要求，可有效降低操作风险，且检测时长较传统PCR短，可大规模适用于口岸一线。

关键词：
传染病疫情
实时荧光PCR
性能验证
新型冠状病毒
核酸提纯
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新型冠状病毒感染疫情是近年影响最大的一次传染病疫情[1],世界卫生组织将引起此次疫情的病毒命名为“新型冠状病毒”(SARS-CoV-2)[2,3]。国家卫生健康委发布的各版新型冠状病毒感染(COVID-19)诊疗指南，均将病原学检测作为COVID-19的确诊指标[4,5],反转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR,RT-PCR)作为检测人员日常工作中最广泛使用的检测方法[6,7],在操作过程中受到诸多因素影响[8,9,10],易导致结果失真[11]。本验证实验通过对国家药监局已批准上市的一体化核酸快速检测系统(下称一体机)和配套的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒进行性能验证，探讨新型冠状病毒感染疫情的常态化需求和应对口岸短时间内检测大量样本的应急检测挑战，并尽可能的保护检测人员，重点突破多样本、一体化、智能化的核酸快速检测相关技术，使之形成标准化、智能化的核酸快速检测系统，做到“样本进、结果出”,实现封闭式全流程的一体化快速检测，以满足“平战结合”的现实需求[12]。

1、材料与方法

1.1材料

实验材料为新型冠状病毒核酸检测标准品，ORF1ab、N和E基因的拷贝数浓度分别为7.51×108copies/ml、8.70×108copies/ml、7.53×108copies/ml(上海计量科学研究院);0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)(购自上海生工，批次：20220101)。

1.2仪器与耗材

全自动核酸提取纯化及实时荧光PCR分析系统(AutraMic mini4800 Plus),300μl一次性使用移液吸头(货号OHC0475,规格96人份/盒),MIC tubes and caps延长件(LIFERIVER版)-有孔(货号OHC0432,规格960人份/盒),试剂混匀管(Autrax专用)(货号PR-0005,规格50人份/盒),样本保存液(型号：RVR09)(货号Z-PR-0028-100,规格100管/盒),核酸提取试剂(型号：MVR06,Z-ME-0089-120A,规格120人份/盒)。

核酸提取试剂(批号：P20211201)、新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(批号：P20220101)、全自动核酸提取及荧光PCR分析系统(AutraMic mini 4800)均购自上海之江生物科技股份有限公司。

1.3方法

1.3.1特异性验证

准备24份样本，其中12份阳性样本以新型冠状病毒标准品模拟阳性样本，2份高浓度(约106copies/ml),6份中浓度(约105copies/ml),4份中浓度(约105copies/ml),由上海计量科学研究院标准品梯度稀释而成，另外12份为厂家质控阴性样本。将24份样本交替排列依次进行提取和检测，记录结果，统计阳性和阴性样本检出率。

1.3.2重复性验证

用PBS对标准品进行10倍和2倍梯度稀释，稀释成6个浓度梯度，分别为P0(ORF1ab、N和E基因浓度分别为7.51×106copies/ml、8.70×106copies/ml、7.53×106copies/ml),P1(ORF1ab、N和E基因浓度分别为7.51×105copies/ml、8.70×105copies/ml、7.53×105copies/ml),P2(ORF1ab、N和E基因浓度分别为7.51×104copies/ml、8.70×104copies/ml、7.53×104copies/ml),P3(ORF1ab、N和E基因浓度分别为7.51×103copies/ml、8.70×103copies/ml、7.53×103copies/ml),P4(ORF1ab、N和E基因浓度分别为7.51×102copies/ml、8.70×102copies/ml、7.53×102copies/ml),P5(ORF1ab、N和E基因浓度分别为375.5copies/ml、435copies/ml、376.5copies/ml),将稀释完的样本在全自动核酸提取纯化及实时荧光PCR分析系统(AutraMic mini 4800)上进行核酸提取及检测，每个浓度重复10次。记录结果，统计阳性和阴性样本检出率。见表1。

表1标准品梯度稀释表

1.3.3精密性和最低检出限

用96份模拟阳性样本，其中10份阳性Ct值≤30,40份弱阳性Ct值≥35和46份阴性，分别标记为S1～S96,在全自动核酸提取纯化及实时荧光PCR分析系统(AutraMic mini 4800)进行检测，同时采用实验室经典实时荧光PCR方法同步检测新型冠状病毒，以经典的实时荧光PCR检测结果作为参照，记录结果，统计阳性样本的阳性检出率和阴性样本的阴性检出率进行对比。

1.3.4设备检测时长验证

分别用秒表记录样本从系统开始运行到检测出结果的时长，记录结果并统计分析。

1.3.5统计学方法

实验数据用SPSS 25.0软件对数据进行分析。精密度采用变异系数(CV)表示，计数资料采用率(%)表示，计量资料采用

表示，以P<0.05为差异有统计学意义。检验水准α=0.05。

2、结果

2.1特异性验证

50份阳性样本均有扩增曲线，符合阳性判定标准，阳性样本的阳性检出率为100%(各浓度样本的Ct均值：P1浓度的ORF1ab基因和N基因Ct均值为23.06和24.00,P2浓度的ORF1ab基因和N基因Ct均值为26.28和27.33);46份阴性样本无扩增曲线，均符合阴性判定标准，阴性样本的阴性检出率为100%。

2.2重复性

阴阳性符合率结果：阴阳性结果一致，阴阳性符合率高，见表2。

表2阴阳性符合率比对结果

2.3精密性和最低检出限

精密性：10次重复的检测结果阳性符合率为≥90.00%(均为100.00%),且CV≤5.00%(0.36%～2.24%),结果符合要求。见表3。

表3强阳性和弱阳性样本的精密度结果

最低检测限：重复检测浓度约为300copies/ml的P6样本10次，ORF1ab基因和N基因均有明显扩增曲线且均符合阳性判定标准，且Ct值<43.00,阳性检出率为100.00%,符合试剂盒所示检测限。见图1。

图1 ORF1ab基因和N基因的扩增曲线图

2.4设备检测时长结果

检测时长1.81～2.10h,中位数为1.92h。

3、讨论

性能验证是通过实验数据验证检测设备的有效手段[13]。经典PCR方法有能在体外快速拷贝所需DNA片段、检测结果准确度高等优点，同时存在所需技术含量高、仪器设备多、时间长等缺点。本次验证的国产全自动核酸提取及检测分析系统，一次可处理48份样本，可实现核酸提取、模板加样、扩增出结果的全自动化运行。在一体机测试中，其运行稳定，未发现仪器报错。测试显示，上机前所需的手工操作为反应体系配置和样本加样，48份样本用时约10min,从一体机开始运行到最终扩增完成出结果的时长约2h。手工操作时间较短，中途无需人工操作，该一体机自动化程度较高，可有效缓解实验操作人员面对大样本量、持续工作时的压力。

在交叉污染测试中，阴性和阳性符合率均为100%,证明该一体机在防污染方面的设计和措施有效[14]。在日常实验室检测工作中，实验室污染大多由人工操作失误造成，自动化操作可有效降低人为失误导致实验污染的可能性。另外，该一体机运行时，全封闭的负压环境也进一步降低了实验室生物安全暴露风险。

灵敏度试验结果显示，该一体机的灵敏度可达到试剂盒所标检测限，重复性CV值均在5%以内。与经典方法相比，96份样本的阴性和阳性符合率均为100%。由此可以看出，本次检测验证的一体机灵敏度、重复性、准确性等各项性能与经典的手工-半自动检测方法一致[15,16],仅增加了全自动化操作系统，理论上灵敏度和准确性等同于经典方法，且传统的PCR检测用时3～4h,本设备用时更短。

综上所述，本次验证的一体机，相对于传统的实时荧光PCR法[17],在保证结果准确的前提下，实现了从提取样本到出具结果的全自动检测，可大大缓解实验人员的工作压力和操作强度，并能有效降低因人工操作失误而导致的实验偏差，同时减少实验人员与样本的接触时间和频次，保障其安全，为常态化防控提供更好的技术和设备支撑。此外，在负压环境下，从最初拧盖到出具结果的全流程自动化设备，对于场地、实验条件、操作人员的要求相对较低，加之本次验证的设备体积小，适合于方舱或应急场所等狭小空间，更便于检测设备向一线关口前移[18,19,20]。

利益冲突无

参考文献:

[1]韶萌,刘春霞.新冠病毒核酸检测系统的性能验证及评价[J].南通大学学报(医学版),2021,41(4):381-383.

[2]侯宁宁,陈颖,任晋生,等.新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的起源和检测方法[J].药物评价研究,2020,43(4):620-623.

[3]梁瑞英,梁琳,贾亚雄,等.新型冠状病毒一步法可视化恒温快速检测方法的建立[J].病毒学报,2020,36(6):983-988.

[4]何吕芬,李沙,利振坤,等.新型冠状病毒实时荧光RT-PCR检测的性能验证[J].分子诊断与治疗杂志,2020,12(7):848-851.

[5]张云丽,王鑫,邵玲,等.1种新型冠状病毒核酸检测试剂的性能验证[J].临床检验杂志,2020,38(11):827-830.

[6]中华人民共和国国家卫生健康委员会办公厅,国家中医药管理局办公室.关于印发新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)的通知[EB/OL].(2020-08-18)[2023-02-10].

[7]刘文明,江涛,吴友琴,等.一种国产新型冠状病毒核酸快速检测分析仪的性能验证[J].中国医疗器械信息,2021,27(22):1-3.

[8]周聪,陈泳桥,彭绮粤,等.新冠病毒核酸检测关键影响因素分析[J].中国国境卫生检疫杂志,2023,46(3):259-262.

[10]崔学强,李富荣,张伟宏,等.不同因素对新型冠状病毒核酸检测结果的影响分析[J].宁夏医学杂志,2020,42(8):739-741.

[11]张瑞,李金明.如何减少新型冠状病毒核酸检测的假阴性[J].中华医学杂志,2020,100(11):801-802,804.