血小板的输注主要用于预防和治疗血小板减少或功能异常而引起的出血，是目前临床上采取的一项重要支持疗法。但是，反复多次输入血小板易使患者产生同种免疫反应，导致血小板输注无效(platelet refractoriness, PRT)的发生。引起PTR的原因包括非免疫和免疫因素。非免疫因素，比如脾肿大、感染等，积极治疗原发病是可以避免的。但是对于免疫因素引起PTR则一直困扰着临床的医师，研究显示[1],长期输注血小板的患者中有26%～71%会产生HLA抗体，而其中有10%常常合并血小板特异性抗体。因此，为了更好地解决血小板的输注无效问题，常常进行人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)基因配型，血小板表面表达的HLA-Ⅰ类抗原，包括HLA-A、HLA-B抗原和少量HLA-C抗原[2]。目前国内外对于血小板表面抗原的研究主要集中在HLA-A、HLA-B位点的抗原，而对血小板细胞膜上HLA-C抗原的研究较少。位于自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)细胞和部分T细胞表面的自然杀伤细胞免疫球蛋白受体(killer immunoglobulin-like receptors, KIR)分子的配体主要是HLA-Ⅰ类分子，两者组成KIR-HLA受配体复合物，通过传导抑制或激活信号来调节NK细胞和T细胞活性，在造血干细胞移植、母胎耐受、抗感染免疫、肿瘤免疫及自身免疫性等疾病中发挥着重要调节作用[3,4,5]。在以往的研究中[6],我们发现HLA-C基因与血小板输注无效存在一定关联性。本研究旨在通过血液病患者输注血小板的研究，探讨受者KIR、供者HLA配体、供-受者HLA配体匹配性以及“受者KIR-供者HLA配体”错配与血小板输注无效的相关性。

1、材料与方法

1.1仪器与试剂

PCR仪(ABI 9700,美国ABI公司),3D多功能流式点阵仪(FLEX MAP 3D,美国One Lambda公司)。人类白细胞抗原HLA-ABC基因分型检测试剂盒(江苏伟禾),DNA提取试剂盒(康为世纪),流式细胞仪(DxFLEX,Beckman Coulter)。血小板交叉配型试剂盒(Sanquin MASPAT kit)。

1.2研究对象

白血病患者33名，选自2020—2022年来本血液中心交叉配型的血液病患者，男11例，女22例，平均年龄(49.5±6.5)岁。其中急性髓细胞白血病16例，急性淋巴细胞白血病17例，进行了74人次血小板输注。33名患者均为连续输注血小板无效次数≥2次以上，符合血小板输注指征，临床上出现瘀斑、皮肤、牙龈等出血，血小板计数<20×109/L。采用HLA抗体检测试剂盒(美国One Lambda公司LAB Screen Mixed试剂盒，批号为019),对患者进行抗体检测，抗体为阳性的纳入研究对象，阴性则舍去。本研究经过本中心伦理审查委员会审批(XZLSC-2023002)。

1.3固相凝集法

采用固相凝集法进行供者和患者的血小板交叉配型。严格按血小板抗体检测试剂盒说明书操作。

1.4 DNA提取

使用康为世纪DNA提取试剂盒采用手工方法提取全血中的DNA。DNA浓度≥100 ng/μL,纯度为A260/280=1.70～1.90之间。

1.5KIR基因检测

采用PCR-SSP法对白血病患者进行KIR基因分型，KIR基因2DL1,2DL2,2DL3,2DS1,2DS2,3DL1,3DS1引物序列和PCR反应体系，循环条件参照文献[7,8]。所有引物均由大连生工生物技术有限公司合成并经过Blast验证。

1.6 KIR配体检测

采用PCR-SSP法对血小板供者的配体HLA-C1、HLA-C2、HLA-B Bw4-80I、HLA-B Bw4-80T、HLA-A Bw4进行检测。引物序列和PCR反应体系，循环条件参照文献[7,8]。所有引物均由大连生工生物技术有限公司合成并经过Blast验证。

1.7血小板输注有效判定标准

以输入血小板后18～24 h的血小板校正计数增加值(corrected count increment, CCI)判定血小板输注效果，CCI=[(输入后血小板计数-输入前血小板计数)]×体表面积(m2)/输入的血小板总数(×1011)。CCI>4.5×109/L为输注有效，否则为无效[9]。

1.8 KIR-HLA错配模式定义

KIR2DL1-C2错配：受者存在KIR2DL1基因，供者缺失C2组HLA位点；KIR2DL2/2DL3-C1错配：受者存在KIR2DL2/2DL3基因，供者缺失C1组HLA位点；KIR3DL1-HLA-Bw4错配：受者存在KIR3DL1基因，供者缺失HLA-Bw4组HLA位点，其中HLA-Bw4包括HLA-A Bw4,HLA-B Bw4-80T,HLA-B Bw4-80I。

1.9统计学分析[10]

采用直接计算法统计KIR及HLA配体检出频率(F%),F(%)=阳性基因数/研究组总人数；KIR-HLA配体复合物的检出频率按照如下受配体的识别方式进行：KIR2DL1-HLA-C2,KIR2DL2/2DL3-HLA-C1,KIR3DL1-HLA-A Bw4,KIR3DL1-HLA-B Bw4-80I和KIR3DL1-HLA-B Bw4-80T;SPSS19统计软件进行χ2检验。本研究所有统计检验均采用双侧检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1受者KIR基因与血小板输注无效的相关性

受者KIR框架基因2DL1,2DL3,3DL2均出现于无效组和有效组中。在无效组中2DL2和2DS2基因检出频率均为40.5%,而有效组中两者的频率为34.4%,前者的频率略高于后者。无效组中2DS1,3DL1和3DS1基因检出频率分别为57.1%,83.3%,45.2%均低于有效组，分别为59.4%,87.5%,59.4%。以上各组差异比较无统计学意义，结果如表1所示。

表1受者血小板输注无效组(n=42)与有效组(n=32) KIR基因检出频率比较(%)

2.2供者HLA配体及HLA-C1C2基因型与血小板输注效果的相关性

33例血液病患者共进行了74人次血小板输注。供者存在C2基因，HLA-B Bw4 80T基因，C1C2基因型，受者输注血小板无效的频率分别为69.0%,50.0%,52.4%,显著高于有效组25.0%,21.9%,25.0%,两者比较差异有统计学意义，P<0.05。供者存在C1基因，C1C1基因型，受者输注血小板有效的频率分别为100.0%,75.0%,显著高于无效组83.3%,31.0%,两者比较差异有统计学意义，P<0.05。当供者存在C2基因，C2C2基因型，受者输注血小板发生无效为29例(69.0%)和7例(16.7%),而有效组为8例(25.0%)和0例，其余各组比较，差异无统计学意义，结果见表2。

表2供者HLA配体及HLA-C1C2检出频率

2.3受者抑制性KIR(inhibitory KIR receptors, iKIR)-供者HLA配体匹配性与血小板输注效果的相关性

当受者-供者匹配模式为KIR2DL1-C2和KIR3DL1-(HLA-B Bw4-80T)受者输注血小板发生无效的频率为69.0%和40.5%,高于有效组的频率25%和18.8%,两者比较差异具有统计学意义，P<0.05。当受者-供者匹配模式为KIR2DL3-C1,KIR2DL2-C1C1, KIR2DL3-C1C1和KIR3DL1-(HLA-B Bw4-80I),受者输注血小板发生有效为32例(100.0%),9例(28.1%),24例(75.0%),15例(46.9%)分别高于无效组35例(83.3%),3例(7.1%),13例(31.0%),10例(23.8%),前者的频率高于后者，且两者比较差异具有统计学意义，P<0.05。当受者-供者匹配模式为KIR2DL1-C2C2,受者发生血小板输注无效7例，而发生有效输注0例，其余各组比较，差异无统计学意义，结果见表3。

表3供者iKIR-受者HLA配体匹配性与血小板输注效果的 相关性

2.4“受者iKIR与供者HLA配体”错配与血小板输注效果的相关性

受者iKIR与供者HLA配体发生错配，错配模式为KIR2DL1-C2错配，受者输注血小板有效的频率为78.1%,远高于无效组的31.0%,两者比较差异具有统计学意义，P<0.05。当错配模式为KIR3DL1-(HLA-B Bw4 80T)错配，受者血小板输注有效的频率为68.8%远高于无效组的42.9%,两者比较差异具有统计学意义，P<0.05。当错配模式为KIR2DL2/2DL3-C1,受者输注血小板均发生7例无效，而有效例数为0,其余各组比较，差异无统计学意义，结果见表4。

表4血小板输注效果与KIR-HLA错配的关系

3、讨论

KIR由位于白细胞受体复合物内的KIR基因编码，表达于NK细胞表面，可分为抑制型(L型)、激活型(S型)和沉默型(P型)[11]。不同类型的KIR与靶细胞表面相应HLA分子结合，可形成不同的信号，抑制或者活化NK细胞活性，从而调控NK细胞对靶细胞的杀伤作用[7]。根据HLA-C分子αl螺旋区的第80位氨基酸残基与KIR分子识别方式的不同，HLA-C分子被分为HLA-C1和HLA-C2两组。HLA-C1组特异性识别抑制性KIR2DL2/2DL3,HLA-C2组特异性识别抑制性KIR2DL1。KIR3DL1识别HLA-Bw4血清学表位[8],根据HLA-B分子第80位氨基酸残基为异亮氨酸或苏氨酸，HLA-B Bw4又可以进一步分为HLA-B Bw4-80I和HLA-B Bw4-80T[12],KIR3DL2的配体为HLA-A3,A11[13],但是在绝大多数个体体内检测不到KIR3DL2基因的mRNA表达[14],所以我们未将KIR3DL2基因纳入到研究对象。

近几年，由iKIR-HLA“错配模式”引起的NK细胞异源反应性在造血干细胞移植中促进移植物植入以及增强移植物抗白血病效应的作用，成为国内外学者研究的热点。KIR-HLA错配模式定义为供者NK细胞存在iKIR受体，受者体内缺失相应的HLA配体分子，表达这种供者来源KIR受体的NK细胞具有潜在的异源杀伤活性[15]。同时血小板输注，从某种程度上也属于移植范畴，KIR-HLA受配体模式也有可能在其中发挥一定作用。所以，我们只研究了与KIR-HLA受配体相关的受者iKIR基因，包括KIR2DL1,KIR2DL2,KIR2DL3,KIR3DL1;供者HLA配体，C1,C2,HLA-A Bw4,HLA-B Bw4-80I和HLA-B Bw4-80T。由于血小板表面不存在NK细胞，所以我们将错配模式定义为受者NK细胞存在iKIR受体，供者体内缺失相应的HLA配体分子。

目前在临床上对于PTR的患者除了采取同型输注、单采血小板，往往还对供者和患者进行血小板交叉配型避免PTR。但是在影响血小板输注效果的因素中，非免疫因素超过50%之多。本文通过详细询问患者病史和电话跟踪随访，患者是否脾肿大，近期或输注期间是否有发热，患者病情是否稳定，是否服用抑制或升血小板的药物等排除非免疫因素对血小板输注的影响。同时，在患者输注血小板前，我们采用固相免疫凝集法进行血小板的交叉配型，此方法操作简便、快速、经济，可解决同种免疫反应导致的PTR,理论上可同时避免因产生抗-HLA、抗-HPA及抗-CD36导致的PTR[16]。但是即使如此，我们发现33例白血病患者进行74人次血小板输注后，仍超过半数发生血小板输注无效，达到了42人次，只有32人次血小板输注有效。从表2可知，当供者存在C2基因，HLA-B Bw4 80T基因，受者输注血小板发生无效的频率显著高于有效组，当供者体内存在C1基因，受者输注血小板有效的频率高于无效组，提示C2和HLA-B Bw4-80T基因是血小板输注无效的易感基因，C1基因是血小板输注无效的保护基因。当供者存在C2C2基因型，受者输注血小板全部发生无效，有效的例数为0,进一步提示C2基因是血小板输注无效的易感基因。2022年邓志辉等[17]报道，肝移植患者体内存在C2基因时会增加急性排斥反应的风险，这说明C2基因在异体移植中可能是1个影响移植物存活的风险基因。表2中供者体内存在C1C1基因型时，受者血小板输注无效率从83.3%,下降到31.0%,说明C1基因是影响血小板输注效果的保护性基因。2012年高学军[18]在对KIR和HLA-C基因多态性与慢性乙肝的相关性的研究中发现，与对照组(57.9%)比较慢性乙肝患者(43.4%)C1C1频率较低，同样提示C1基因是慢性乙肝的保护性基因，这与本文研究一致。而本研究发现的HLA-B Bw4-80T基因是血小板输注无效的易感基因，在国内未见相关报道。进一步分析受者iKIR-供者HLA配体的匹配性与血小板输注效果的关系，从表3可知，供者存在C2和HLA-B Bw4-80T基因，受者-供者KIR2DL1+C2和KIR3DL1+HLA-B Bw4-80T匹配，受者血小板输注以无效为主，KIR2DL1+C2和KIR3DL1+HLA-B Bw4-80T受配体的相合不能抑制NK细胞溶解血小板作用。当供者存在C1基因时，受者输注血小板有效比例显著提高，高于无效组可能通过KIR2DL2/2DL3+C1的受配体组合模式来抑制NK细胞的活性，防止血小板被溶解和吞噬。从表4我们发现，当受者iKIR-供者HLA配体错配时，KIR2DL2/2DL3+C1错配，即受者存在KIR2DL2/2DL3,供者血小板缺少C1配体，受者输注血小板发生无效的7例，有效0例，这可能是由iKIR-HLA“错配模式”引起的NK细胞异源反应性导致NK细胞激活溶解血小板。KIR2DL1+C2和KIR3DL1+HLA-B Bw4-80T错配，受者存在KIR2DL1,KIR3DL1,供者缺少C2,HLA-B Bw4-80T配体，受者输注血小板发生有效频率大于无效。虽然缺少C2和HLA-B Bw4-80T配体，但是因为存在C1基因这个血小板输注无效的保护性因素，所以iKIR-HLA“错配模式”未能引起NK细胞异源反应性，血小板未遭到破坏。

综上所述，在血小板输注中HLA-C1和HLA-C2基因是影响血小板输注效果的关键性因素，HLA-C1是血小板输注无效的保护性基因，而HLA-C2和HLA-B Bw4-80T是血小板输注无效的易感性基因，受者iKIR+供者HLA的受配体模式在血小板输注无效中的可能机制基于目前国际上的研究结果不能很好阐释，还有待于输血届同仁的进一步研究和发现。总之，本研究从基因的角度对血液病血小板输注无效的免疫性因素进行了回顾性分析，具体还需进一步从特异性免疫抗体的表达方面来进行深入的研究。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。

参考文献:

[2]李勇实用血液免疫学:血型理论和实验技术[M].北京:科学出版社, 2006 :284.

[6]韩瑜,杨帆,焦立新,等.血小板输注效果和HLA-C基因关联性研究[J]中国输血杂志,2019,32(5):417-420

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[12]甄建新南方汉族KIR系统分子遗传多态性及其与白血病的关联研究[D].南方医科大学, 2014.

基金资助:吉林省卫生健康科技能力提升项目(2022JC088);

文章来源:韩瑜,杨帆,焦立新等.血小板输注效果与KIR-HLA受配体相合度的相关性研究[J].中国输血杂志,2023,36(07):