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血清外泌体let-7d-3p与miR-30d-5p在宫颈癌中诊断价值

2023-08-02 95 上传者：管理员

摘要：研究探索血清外泌体miRNA let-7d-3p与miR-30d-5p在宫颈癌患者中的表达，为宫颈癌早期诊断寻找新的肿瘤标志物。方法选取海南医学院第一附属医院2019年1月到2020年12月收治的宫颈癌患者与体检健康人群，采用qRT-PCR法检测血清外泌体let-7d-3p与miR-30d-5p的表达水平，ROC曲线分析目标基因在宫颈癌中的诊断价值，研究目标基因表达水平与宫颈癌患者临床特征的相关性。结果宫颈癌组血清let-7d-3p的表达水平是健康人群的1.95倍，miR-30d-5p表达水平宫颈癌组是健康人群的2.35倍。经检验差异均有统计学意义（P均<0.05）。二者联合诊断宫颈癌具有较好的诊断效能，曲线下面积为0.925。let-7d-3p与miR-30d-5p的表达水平与年龄和病理类型无关（P均>0.05），与肿瘤直径、淋巴结转移和FIGO分期呈正相关（P均<0.05）。结论血清外泌体let-7d-3p与miR-30d-5p联合对宫颈癌的早期诊断具有一定临床价值，其表达水平与肿瘤进展有关。

关键词：
miRNA
外泌体
宫颈癌
诊断
遗传物质
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外泌体是细胞分泌的囊泡膜，直径约30～150 mm，其携带大量的遗传物质且肿瘤的发生发展与转移密切相关[1,2]。在这些遗传物质携带了母细胞的信息，外泌体的双层囊泡结构保证了这些遗传物质不易被降解，且外泌体广泛存在于血液、尿液、胸水等多种体液中[3]，液体活检作为非侵入式的检测手段在临床上具有显著优势。在这些遗传物质中，mi RNA具有相对稳定的特征和成熟的检测方法成为了非常有前景的肿瘤诊断标志物[4]。Zheng一项研究表明let-7d-3p与mi R-30d-5p在宫颈肿瘤与邻近正常组织之间存在显著差异，是宫颈癌诊断的有价值的诊断性生物标志物[5]，但是仍然需要临床样本的进一步验证。基于此，本研究探索血清外泌体mi RNA let-7d-3p与mi R-30d-5p在宫颈癌患者中的表达，为宫颈癌早期诊断寻找新的肿瘤标志物。

1、资料与方法

1.1资料来源

选取2019年1月至2020年12月就诊于海南医学院第一附属医院，经宫颈活检病理确诊为宫颈鳞癌或腺癌的患者56例，纳入标准为：患者抽血前未接受手术或者放化疗；无其他系统合并症；病例资料完整无缺失。另外选取体检中心健康妇女50例，纳入标准：年龄40岁以上；宫颈经筛查无宫颈病变，彩超检查无妇科其他疾病；既往无宫颈病变或其他妇科疾病手术史；既往无恶性肿瘤或其他系统疾病病史。宫颈癌组平均年龄为（54.62±8.56）岁，健康人群组平均年龄为（52.60±4.95）岁，经对比差异无统计学意义。同时收集纳入研究的宫颈癌患者的临床资料，包括FIGO分期、病理类型、年龄、肿瘤直径、淋巴结转移情况等。本研究经海南医学院第一附属医院医学伦理委员会审批（伦理号：20190113），所有病人均知情同意并签署知情同意书。

1.2外泌体分离与鉴定

用EDTA抗凝管取受试者血清2 m L，在4 h内4℃保存的条件下以2000×g离心20 min，取上清液10000×g离心20 min，收集上清。加入外泌体分离试剂（广州锐博生物技术有限公司），涡旋振荡1 min，放置于4℃冰箱静置30 min。取出装有混合液的离心管，4℃，15000×g离心2 min，弃上清，收集富含外泌体的沉淀。该上清液即富含外泌体颗粒的溶液。将收获的外泌体颗粒粗制品转入EP柱上管中，于4℃条件下3000×g离心10 min，收集管底的液体，即为纯化后的外泌体颗粒。

将10μL外泌体溶液滴加到铜网上，室温吸附10 min左右，用滤纸小心吸去多余的液体。然后向铜网上滴加10μL 2%的磷钨酸溶液，在室温下对外泌体染色处理2 min，小心用滤纸吸去多余的染色液，将铜网在室温下晾干。采用透射电镜观察外泌体形态。采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测外泌体表面特异性标志蛋白CD9、CD63和TSG101。

1.3提取血清外泌体与q RT-PCR

用mi RNA提取试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）严格按照说明提取mi RNA，随后进行mi RNA反转录。采用Primer Premier 5.0软件设计引物，采用mi R-129-5p作为内参基因[5]，引物设计见表1。用q RT-PCR试剂盒（美国Sima公司）检测mi RNA相对表达量，检测步骤严格按照试剂盒说明书进行。每个样本实验重复三次结果取平均值，用2–ΔΔCt公式计算的各目的mi RNA的实际表达量，用2–ΔΔCt公式计算的各目的mi RNA的相对表达量。

表1 PCR引物序列

1.4统计学处理

采用SPSS 25.0进行数据统计，计数资料采用均数±标准差表示，计数资料采用百分比表示。组间资料符合正态分布采用独立样本的t检验进行。绘制受试者操作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC曲线）并通过曲线下面积（area under curve,AUC）评估目标基因的诊断效能。相关性分析根据因变量类型采用二元Logistic回归或有序Logistic回归进行分析。P<0.05认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1鉴定血清外泌体

在透射电镜下可见外泌体呈圆形双层囊泡结构，见图1a。通过NTA技术检测外泌体囊泡直径，结果显示颗粒直径30～200 mm占99%，表现为单峰正态曲线，峰值约为105.7 mm。Western blot检测在血清沉淀物中检测到外泌体表面标物CD9、CD63与TSG101的表达，见图1B。

图1血清外泌体的鉴定

2.2两组血清let-7d-3p与mi R-30d-5p的表达水平

两组患者血清let-7d-3p与mi R-30d-5p的表达水平见表2，检验显示宫颈癌组血清let-7d-3p的表达水平是健康人群的1.95倍，mi R-30d-5p表达水平宫颈癌组是健康人群的2.35倍。经检验差异均有统计学意义（P均<0.05）。

表2实时荧光定量PCR检测各组中2个目的mi RNA的表达水平及其比较结果

2.3 let-7d-3p与mi R-30d-5p联合诊断宫颈癌的价值

let-7d-3p与mi R-30d-5p诊断宫颈癌的ROC曲线见图2。曲线下面积、敏感度、特异度、阳性预测值及阴性预测值。经检验，血清let-7d-3p诊断宫颈癌的最佳截断值为>3.04，血清mi R-30d-5p诊断宫颈癌的最佳截断值为>1.33,2者联合诊断宫颈癌明显提升了诊断效能，曲线下面积为0.925，其敏感度、特异度、约登指数见表3。

图2 let-7d-3p、mi R-30d-5p与二者联合诊断宫颈癌的ROC曲线

2.4 let-7d-3p与mi R-30d-5p表达水平与宫颈癌患者临床特征相关性

为了了解let-7d-3p与mi R-30d-5p表达水平与宫颈癌患者临床特征的相关性，将let-7d-3p与mi R-30d-5p表达水平以中位数为截断值（3.71与2.57）分为高表达组与低表达组。然后根据收集的宫颈癌的患者的临床特征进行相关性分析发现，let-7d-3p与mi R-30d-5p的表达水平与年龄和病理类型无关（P均>0.05），与肿瘤直径、淋巴结转移和FIGO分期呈正相关（P均<0.05），具体见表4。表明let-7d-3p与mi R-30d-5p表达可能与肿瘤的发展与转移有关。

表3血清外泌体中目的mi RNA对宫颈癌的诊断效能

表4 let-7d-3p与mi R-30d-5p表达水平与宫颈癌患者临床特征相关性

3、讨论

宫颈癌是女性最为常见的恶性肿瘤之一，2018年在全球范围内约有570000例新发病例和311000例患者死亡[6]。宫颈癌的早诊早治对提高宫颈癌患者生存时间改善生活质量具有着重要的价值。宫颈细胞学检查与HPV检查是最成功的癌症筛查手段，大幅度降低了宫颈癌的发病率并提高了宫颈癌患者的5年生存率[7,8]。但这两种筛查手段都需要从受检者子宫颈收集组织，存在感染及出血的风险，并且会造成疼痛及不适。且宫颈细胞学检查需要人工阅片，在欠发达地区缺乏足够的专业人员，高质量的宫颈癌细胞学筛查仍需普及。因此，高效能的血清学诊断标志物一直是我们探索的重要目标。

在血清外泌体携带的遗传物质中，mi RNA受到了我们的关注。mi RNA作为一种长约22核苷酸的非编码RNA分子，阻碍m RNA的翻译或触发其降解[9,10]。循环mi RNA已经成为许多疾病的有价值的无创的诊断生物标志物，包括癌症、代谢紊乱和妊娠相关并发症[11,12]。这些mi RNA在不同的体液中都很稳定，如血浆、尿液和唾液。此外，血浆和肿瘤细胞的mi RNA谱之间的强相关性表明，当mi RNA从组织中释放并脱落到循环[13]中时，它们可能保持稳定。本次研究对血清外泌体mi RNA在宫颈癌诊断的价值进行了探索。发现宫颈癌组血清let-7d-3的表达水平是健康人群的1.95倍，mi R-30d-5p表达水平宫颈癌组是健康人群的2.35倍，二者联合诊断宫颈癌具有较强的诊断效能，其曲线下面积为0.925，表明let-7d-3p与mi R-30d-5p可以区别宫颈癌患者与健康人群，是潜在的宫颈癌诊断血清肿瘤标志物。同时我们还研究了let-7d-3p与mi R-30d-5p表达水平与宫颈癌患者临床特征相关性，发现二者表达水平越高，患者肿瘤直径越大，淋巴结转移风险越高，疾病分期越晚，表明let-7d-3p与mi R-30d-5p的表达可能与宫颈癌的发展与转移有关。

既往研究表明，let-7d-3p与mi R-30d-5p均在肿瘤的发生发展过程中起了重要作用。let-7d-3p可以与TLR4特异性结合，TLR4广泛存在于阴道、子宫与卵巢组织中，与细胞增殖密切相关[14]。有研究表明，TLR4在鳞状细胞癌中异常表达，是角质形成细胞的负调控因素[15]，在卵巢癌、子宫内膜异位症的发生中均起到一定作用[16,17]。研究发现mi R-30d-5p在非小细胞肺癌组织中下调可显著抑制癌细胞的生长、侵袭与迁移[18]。还有研究表明，mi R-30d-5p在胆囊组织中高表达并通过调节LDHA，在胆囊癌发生发展过程中起重要作用[19]，也有研究发现直肠癌、前列腺癌中均出现了mi R-30d表达失调[20,21]。

本次研究缺陷在于样本量较小，对于诊断的最佳截断值还需要大样本数据进行研究。本次研究未检测宫颈癌前病变与HPV感染患者血清let-7d-3p与mi R-30d-5p的水准，对其宫颈癌鉴别诊断的意义还需要进一步研究。本次研究对两个目的基因与肿瘤的临床资料进行了相关性分析，但是由于随访时间短，没有对目的基因对预后的影响进行进一步研究。

综上所述，本次研究发现宫颈癌患者血清外泌体let-7d-3p与mi R-30d-5p表达水平明显高于健康人群，联合检测对宫颈癌的早期诊断具有一定临床价值，其表达水平与肿瘤进展有关。

基金资助:海南省自然科学基金(821MS0779);

文章来源:陈韩,杨江怡,陈华等.血清外泌体let-7d-3p与miR-30d-5p在宫颈癌中的诊断价值[J].中国优生与遗传杂志,2023,31(07):