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吸收放散法相对定量获取血浆IgG血型抗体的研究

2024-07-29 76 上传者：管理员

摘要：目的:建立可相对定量获取O型RhD+孕妇血浆IgG抗A、抗B血型抗体的吸收放散法。方法:随机选取95例O型RhD+孕妇血浆，用37℃温吸收、56℃热放散的方法获取血浆抗A、抗B血型抗体，以微柱凝胶抗人球蛋白试验分别测定放散液和血浆IgG抗A、抗B抗体效价，对比分析放散液与血浆抗体效价的差异及相关性。结果:放散液与血浆IgG抗A、抗B抗体效价分别作对数转换（Log2）后，放散液与血浆IgG抗A抗体效价差值与抗B抗体效价差值之间无统计学差异（P>0.05）,放散液IgG抗体效价与血浆IgG抗体效价呈正相关（r=0.914）,经散点图拟合直线方程为Y=-3.55+0.96X。结论:本吸收放散法可相对定量获取IgG抗体效价为8以上的O型RhD+孕妇血浆IgG抗A、抗B血型抗体，同时获取IgG抗A与抗B抗体的效果无差异，且获取的IgG血型抗体浓度能够反映血浆中相应抗体浓度水平。

关键词：
IgG血型抗体
吸收放散法
母婴ABO血型不合
胎儿新生儿溶血病
高胆红素血症
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“ABO血型不合”的胎儿新生儿溶血病(hemolytic disease of the fetus and newborn, HDFN)是目前临床最常见的因母婴ABO血型不合所致，以高胆红素血症、黄疸、贫血、肝脾肿大等为主要临床表现的免疫性溶血性疾病，黄疸严重者可发生核黄疸甚至死亡，其发病率远高于Rh、MNS等其他血型系统不合引起的溶血病[1-3]。根据业内专家共识，当O型RhD+女性的配偶是非O型RhD+时，在备孕阶段或孕期特定时期需多次检测抗A和(或)抗B的IgG抗体效价，以预测HDFN的发生，达到提前干预、改善预后的目的[4]。同时共识中也提出，对于高效价的抗A、抗B血型抗体进行IgG亚类水平研究可预测HDFN的发生及其严重程度。IgG抗体分子有4个亚型(IgG1-IgG4),不同IgG亚型发挥效应的能力不同[5]。常规检测IgG抗体亚类的ELISA法，无法单独检测IgG抗A、抗B血型抗体的亚类，需先从血浆(清)总IgG中分离出特异性抗A、抗B血型抗体。

国外文献报道利用表面等离子体共振、流式细胞术等方法可快速定量或半定量分离获取血浆中特异性IgG抗A、抗B血型抗体[6-7],因需要特殊仪器及较高的技术难度，使这些分离方法难以在日常临床检验中广泛应用。吸收放散法是一组实验方法的综合应用，根据目标抗体类型选择最适反应条件，利用表达靶抗原的红细胞进行“吸收”和“放散”,达到分离血浆中特异性IgG抗体的目的，从而对IgG抗体进行定量[8]。本研究探讨了特定条件下的吸收放散法获取O型RhD+孕妇血浆IgG抗A、抗B血型抗体的效果，希望为特异性血型抗体IgG亚类检测提供帮助。

1、材料和方法

病例

2022年12月-2023年3月随机收集泰州市人民医院剖宫产手术备血的孕妇剩余血浆样本95例(已签《剩余生物样本处置知情同意书》),妊娠38-40周，年龄22-39岁，血型均为O型RhD+,不规则抗体筛查均为阴性。

试剂与仪器

2-巯基乙醇(2-Me)购自上海血液生物医药有限责任公司，ABO标准红细胞(0.8%人血红细胞)、ABO血型反定型检测卡(即微柱凝胶盐水卡)与微柱凝胶抗人球蛋白卡(抗人IgG+C3d)均购自长春博讯生物技术有限责任公司。数显恒温水浴箱购自上海光地仪器设备有限公司，血型血清学专用标准化离心机购自台湾贝索企业有限公司，TD-2Y型医学检验多功能离心机购自中山生科试剂仪器有限公司，FYQ型免疫微柱孵育器购自长春博研科学仪器有限责任公司。

血浆抗A、抗B效价测定

取200μl血浆与200μl 2-Me于一次性小试管中加盖混匀(此管血浆稀释度为1∶2),于37℃水浴1 h后，取160μl于96孔塑制U底微孔板中[9],用等量生理盐水作倍比稀释，稀释板每列微孔中血浆稀释度依次为1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512。用微柱凝胶抗人球蛋白试验分别测定血浆IgG抗A、抗B效价[10],具体操作步骤参照《AABB技术手册》中第二部分相关章节内容，并按技术手册中要求将效价结果记录为血浆稀释度的倒数[11]。根据技术手册的建议，2-Me处理后血浆IgM抗A、抗B抗体效价应小于4(用微柱凝胶盐水卡检测),如大于4则适当延长2-Me试剂的处理时间。

吸收用AB型压积红细胞制备

留取多人份有效期内的AB型RhD+献血员血袋的“辫子”血样各若干份，混合后离心取压积红细胞，用生理盐水洗涤6次，制成压积红细胞待用。制备的压积红细胞用微柱凝胶抗人球蛋白卡检测直接抗人球蛋白试验应为阴性。

吸收试验吸附抗A、抗B血型抗体

另取血浆与制备好的AB型RhD+吸收用压积红细胞各200μl于加盖的一次性小试管中混匀，置37℃水浴1 h,每20 min轻摇混匀以增加抗原抗体接触。孵育完成后取出，用1 000×g离心3 min,吸弃上清。吸弃上清时应避免丢失红细胞，整个操作过程应避免溶血。

放散试验释放抗A、抗B血型抗体

吸收完成后的压积红细胞分别用生理盐水洗涤4次，每次洗涤应使用20倍体积以上的生理盐水(约4 ml),尽量避免丢失红细胞。最后1次洗涤离心后，取上清分别用微柱凝胶盐水卡和抗人球蛋白卡检测其是否残存IgM或IgG抗A、抗B抗体。证实无IgM或IgG抗A、抗B抗体后吸弃上清，向压积红细胞中重新加入400μl生理盐水后轻摇混匀，于56℃水浴箱中进行热放散10 min,热放散试验的具体操作步骤参照《AABB技术手册》。

放散液抗A、抗B效价测定

放散液用生理盐水在96孔U底微孔板中作倍比稀释后，利用微柱凝胶抗人球蛋白卡检测IgG抗A、抗B效价，操作步骤同血浆抗A、抗B效价测定，放散液的效价计为1,稀释板每列微孔中的放散液稀释度依次为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256。用微柱凝胶盐水卡检测放散液IgM抗A、抗B抗体效价，确认IgG抗体效价没有受到可能存在的IgM抗体干扰。

统计学分析

应用SPSS 22.0软件进行统计学处理，将血浆和放散液IgG抗A、抗B抗体效价作对数转换(Log2),分别计算血浆与放散液抗A、抗B抗体效价差值，非正态分布数据采用中位数(四分位数间距)来描述。根据抗体类别分为抗A组和抗B组，采用两独立样本Mann-Whitney U检验比较抗A组与抗B组效价差值的差异；采用两相关样本Wilcoxon秩和检验比较血浆与放散液IgG抗体效价的差异。用效价分布散点图及拟合线进行血浆与放散液IgG抗体效价相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

放散液与血浆IgG抗A、抗B抗体效价分布

分别以95例样本的血浆与放散液IgG抗A、抗B抗体效价(Log2)为纵坐标，样本号为横坐标，绘制抗体效价分布折线图(图1-2),可见放散液IgG抗A、抗B抗体浓度均低于血浆IgG抗A、抗B抗体浓度。

获取抗A抗体与获取抗B抗体比较

将95例样本的血浆与放散液按抗体类别分为抗A组与抗B组，分别计算两组血浆与放散液效价(Log2)的差值，经两独立样本Mann-Whitney U检验，抗A组效价差值与抗B组效价差值之间差异无统计学意义(P=0.058),用本法同时获取IgG抗A、抗B抗体的效果一致(表1)。

放散液与血浆IgG抗体效价的比较及相关性分析

将190例(抗A组与抗B组总和)血浆与放散液IgG抗体效价(Log2)经两相关样本Wilcoxon秩和检验，结果显示放散液IgG抗体效价均小于血浆[3(2,5)对7(6,9),P<0.05)]。汇总计数放散液与血浆抗体效价(Log2)相同的样本(表2),并绘制成散点图(图3),可拟合直线方程为Y=-3.55+0.96X(R2=0.822),经本法获得的放散液IgG抗体效价与其来源血浆对应的抗体效价(Log2)呈正相关(Spearman相关系数为r=0.914)。

3、讨论

吸收放散法在临床输血检验中被广泛应用于疑难血型鉴定及疑难交叉配血[12],是免疫血清学试验中非常重要的技术方法。吸收即用红细胞(提供抗原)在最适条件下充分吸收抗体，而放散则将吸附于红细胞上的抗体用理化方法脱离下来，二者联合运用即可初步分离纯化目标抗体。临床输血检验中血型鉴定与交叉配血试验都是定性试验，无需量化分离的抗体，有时仅需达到排除干扰抗体的效果[13],因而用吸收放散法定量或半定量分离、获取目标抗体的研究较少。另外，因方法学上存在的系统误差和随机误差，即使在理想的实验条件下，吸收放散法获取目标抗体的效率也不能达到100%,这也是本研究所获得的抗体效价均低于原血浆抗体效价的原因。

ABO血型系统有A、B、AB和O型4个主要的表现型，根据基因遗传规律，其对应基因型一般为“AA、AO、BB、BO、AB、OO”6种。虽同为A型或者B型表现型，不同基因型的个体(“AA”与“AO”,“BB”与“BO”)红细胞表面所含A或B抗原数目不同；当A、B基因同时被遗传时，红细胞上B抗原数量接近A抗原数量[14]。如果使用混合多人份A型或B型压积红细胞吸收相应抗体，因抗原量的差异可导致随机误差增加。吸收试验采用AB型压积红细胞，提供的A、B抗原近乎等量且充足，红细胞吸收抗A、抗B抗体无竞争性抑制，抗体与其特异性抗原结合的概率相同，因此，本研究获取抗A抗体与抗B抗体的效果一致，获得的抗体浓度与原血浆中对应抗体浓度呈正相关。

研究显示，孕妇血浆高效价IgG抗A、抗B抗体及其亚类水平与HDFN的发生率及其严重程度高度相关[15-16]。O型人血浆中天然存在IgG抗-A、抗B和抗-AB,抗AB抗体可识别A、B抗原的相同结构部分，如果单独检测IgG抗-A或抗-B的效价可能要比实际结果偏高[17],然而孕妇妊娠期间所有IgG抗体均能够通过胎盘血液屏障后进入胎儿血液，并不区分抗原特异性，一般在产前检查时胎儿血型只依据父母双方血型表现型作出推测，在新生儿未分娩前要研究的目标抗体是未知的，因此本研究没有更进一步分离放散液中的IgG抗A与抗B抗体，以反映O型RhD+孕妇血浆中可能存在的所有IgG抗A、抗B及抗AB抗体的真实水平。

Judd[18]曾设计过多种经典的吸收放散法用于分离血浆中不同的目标抗体，其中有一种是利用多份抗原特异性压积红细胞反复多次吸收，获取样本中全部目标抗体，这会造成目标抗体浓度被稀释。本研究仅用吸收红细胞2倍体积(400μl)的生理盐水作为放散液，以满足对放散液抗体效价的检测，及后续目标抗体亚类检测所需的最低样本量。根据拟合直线方程Y=-3.55+0.96X,如果要得到目标抗体效价为1(20)的放散液，血浆含该目标抗体效价至少应为2的3.6979次方(约为24)再除以2(2倍体积生理盐水作放散液),即本吸收放散法适用的孕妇血浆其目标抗体效价应至少为8。目前临床上普遍认为对HDFN有意义的孕母血浆IgG血型抗体效价至少为64以上[4, 15, 19],因此本吸收放散法能满足后续研究需要。

在应用微柱凝胶抗人球蛋白卡检测血浆IgG抗体效价时，一般需使用2-巯基乙醇(2-Me)或二硫苏糖醇(DTT)预先处理血浆，以排除IgM抗体对抗人球蛋白试验的干扰[20]。已知巯基试剂的作用原理是破坏蛋白质中的二硫键，不同处理时间及巯基试剂有效浓度的不同，血浆(清)样本的消化效果存在差异，处理时间过长、浓度过高会导致抗体分子中所有二硫键变性，故经巯基试剂处理后的样本仅能用于证实IgG抗体的存在，不宜用于后续亚类研究。因此，在放散液IgG抗体效价检测时，仅以放散液的IgM抗体效价作平行对照而不再经2-Me处理。从效价检测结果来看，放散液的抗体浓度相对于原血浆已呈指数倍稀释；同时，本研究采用37℃温吸收，使IgG抗体被最大化吸收，虽IgM抗体亦有部分被吸收，但随着室温下生理盐水洗涤次数的增加，已结合的IgM抗体会被进一步解离，故放散液IgG抗体效价的检测未受到IgM抗体的干扰。

综上所述，本吸收放散法由于没有操作难度、无需特殊的仪器和昂贵的试剂，非常适用于基层临床输血检验及相关实验诊断科室。

参考文献:

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10周朝霞,杨小红.不同抗体效价检测方法评估新生儿溶血病及其参考值的确认.湖南师范大学学报(医学版),2019,16(4):37-39.

11 Mark K.Fung,Brenda J.Grossman.AABB技术手册.桂嵘等,译:中南大学出版社,2019.

12罗娜维.吸收放散试验联合抗体增强方法对ABO疑难血型的诊断分析.实用医技杂志,2021,28(7):910-912.