驱动蛋白分子（kinesins）是以细胞内微管为轨道的动力蛋白，与细胞内细胞器的移动、细胞有丝分裂及减数分裂、组织器官的生长发育以及神经元的发育及信号传导等密切相关[1].Kif18A是Kinesin-8家族中的一员.研究表明，Kif18A对有丝分裂过程中的纺锤体微管动力学和染色体振幅起着重要调控作用[2,3].与其他驱动蛋白分子相同，Kif18A蛋白由3个功能域组成：N端的马达结构域（motordomain）、中央卷曲螺旋杆状结构域（stalkdomain）和C端货物分子结合结构域（taildomain).Kif18A利用水解ATP释放的能量可以沿着微管向正极末端移动，由于其C末端存在另一个微管结合位点，因此Kif18A能够稳定运动到微管正极末端并聚集，进而抑制微管的动态不稳定性[4,5,6,7]，通过降低染色体的振荡速率限制其振荡幅度[8,9,10].有丝分裂关键蛋白激酶CDK1可对Kif18A的S674和S684氨基酸位点进行磷酸化修饰，使得Kif18A无法到达动粒微管的末端并聚集，因此Kif18A无法发挥其降低微管动态不稳定性的功能，使得动粒振幅增大[11].据推测这可能是因为CDK1的磷酸化修饰影响了Kif18A的ATP酶活性，使Kif18A无法到达微管正极末端.

本研究构建了Kif18A突变体的杆状病毒Kif18A-AA(S674A/S684A）和Kif18A-EE(S674E/S684E），利用SF9细胞表达这2种杆状病毒蛋白，通过纯化获得Kif18A-AA和Kif18A-EE蛋白，检测其ATP酶活性，进而分析CDK1磷酸化修饰对Kif18A蛋白ATP酶活性的影响，为深入理解Kif18A在细胞有丝分裂期的功能提供体外实验依据.

1、材料与方法

1.1材料

昆虫细胞SF9，本实验室自存；pFastBac-HTa、pEGFP-Flag-Kif18A-EE、pEGFP-Flag-Kif18A-AA质粒为本实验室前期构建；TransT1、DH10Bac感受态细胞、Kif18A抗体、Kif18A磷酸化抗体均为实验室自制.

1.2试剂

ATPase/GTPaseELIPABiochemKit(Catalognum-ber:BK051/52）、Tubulin和488LabeledTubulin，美国Cytoskeleton公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司；EcoRⅠ和SalⅠ工具酶、SuperFectin试剂，美国ThermoScientific公司；T4连接酶，日本Takara公司；SIMSF培养基，北京义翘神州生物技术有限公司；鼠抗Flag抗体、FlagBeads和3×FlagPeptide，美国Sigma公司.

1.3方法

1.3.1DH10Bac感受态细胞转化

从-80℃冰箱中取出DH10Bac感受态细胞，冰上融化后，加入10ngpFastBac-Flag-Kif18A-EE或pFastBac-Flag-Kif18A-AA质粒，冰上孵育30min后，42℃水浴锅中热激45s，迅速置于冰上2min，加入900μLSOC液体培养基.37℃条件下225r/min摇菌6h，之后取100μL涂平板（50μg/mLKan+,7μg/mLGen+,10μg/mLTet+,0.1mol/LIPTG,2%X-gal），将平板倒置放于37℃培养箱中培养72h.挑取3个白色克隆转接到LB液体培养基（含50μg/mLKan+、7μg/mLGen+和10μg/mLTet+）中，37℃过夜培养，提取杆状病毒基因组.

1.3.2杆状病毒基因组提取

将菌液转移到1.5mL离心管中，14000r/min离心1min，真空吸干上清，加入0.3mL的BufferP1（含有RNaseA）重悬沉淀，混匀后加入0.3mL的BufferP2，室温孵育5min.加入0.3mL醋酸钾（浓度为3mol/L,pH值为5.5），轻轻混匀，蛋白形成白色沉淀.冰上放置10min后14000r/min离心10min，将上清转移到含有0.8mL异丙醇的离心管中.混匀，冰上放置10min.室温下14000r/min离心15min，弃去上清后加入0.5mL70%的乙醇，室温下14000r/min离心5min.室温放置10min风干沉淀，加入40μLpH值为8.0的1×TEBuffer重新溶解DNA沉淀.-20℃储存.

1.3.3PCR验证杆状病毒基因组

1.3.2中得到的杆状病毒基因组须进行PCR验证，确定其是否为发生转座的重组基因组.引物序列：M13F(5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3′），Kif18A-R(5′-CTAATGCCATCTCCCTTGAAAG-3′）.PCR体系：93℃预变性3min;94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸5min,30个循环；72℃终延伸7min,4℃保存.取5μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，110V恒压45min.

1.3.4重组杆状病毒基因组感染SF9细胞

在60cm平板中接种3×106个SF9细胞，27℃下培养30min，使细胞贴壁生长.吸弃培养基，加入3mL新鲜培养基，加入转染试剂（1μg病毒基因组DNA,15μLSuperFectin转染试剂），边滴加边摇匀，27℃条件下培养72h.

1.3.5杆状病毒的收取、扩增及滴度的测定

转染72h后，收集上清为第一代杆状病毒，避光保存在4℃冰箱中.由于转染所得到的病毒滴度较低，不能高效表达目的蛋白，因此要进行杆状病毒扩增，以增加病毒的滴度.用第一代杆状病毒分别在10cm平皿和50mL培养瓶中继续感染SF9细胞，扩增杆状病毒，使其滴度逐步提高.但过高的感染浓度可能会产生不完整的目的蛋白，因此通过调整感染比例（1∶100、1∶500、1∶1000、1∶5000）和感染时间（36、48、60、72h）得到病毒表达蛋白的最佳条件.

1.3.6Kif18A突变体蛋白的表达和纯化

在50mL锥形瓶中接种SF9细胞，细胞密度为1×106mL-1，以杆状病毒最佳感染浓度感染SF9细胞，27℃条件下悬浮培养，在病毒表达蛋白的最佳时间收取细胞并将细胞沉淀冻存于-80℃冰箱中.

由于Kif18A突变体蛋白在SF9细胞中进行表达，因此蛋白要进行纯化.通过对融合到目的蛋白中的Flag标签蛋白进行纯化，就可以得到目的蛋白.向50mLSF9细胞沉淀中加入2mL裂解液（0.3mol/LNaCl,20mmol/LpH值为7.5的Tris-Cl,1%NP-40,1mmol/LPMSF,1mmol/LDTT,10mmol/Lβ-ME,0.5mmol/LATP-Na,1μg/mLApprotinin,1×Cocktail,50μmol/LNa3VO4），将细胞沉淀重悬后，冰上裂解60min，将液体转移至2mL离心管中.4℃下14000r/min离心30min，转移上清到2mL离心管中.加入25μLFlagBeads,4℃下旋转孵育2h后收集上清，用洗液（0.3mol/LNaCl,20mmol/LpH值为7.5的Tris-Cl,1mmol/LPMSF,1mmol/LDTT,10mmol/Lβ-ME,0.5mmol/LATP-Na,1μg/mLApprotinin,1×Cocktail,50μmol/LNa3VO4）清洗Beads3次，加入洗脱液（3×FlagPeptide，稀释比例为1∶20)4℃下洗脱2h，收集第1次洗脱样品.再次加入洗脱液，4℃下过夜，洗脱后收集第2次洗脱样品.将2次所得的纯化蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色1h后进行脱色，观察蛋白纯化的效果.

1.3.7体外微管合成

根据微管合成试剂盒（Cat.#TL488M）说明书合成微管.取1份分装好的微管蛋白（Tubulin和488LabeledTubulin体积比为5∶1），迅速加入等量GeneralTubulinBuffer(80mmol/LPIPES,2mmol/LMgCl2,0.5mmol/LEGTA,1mmol/LGTP,1mmol/LDTT,20μmol/LTaxol).37℃水浴合成2h后，取0.5μL滴片，镜下观察微管合成情况，室温保存合成的微管.

1.3.8Kif18A突变体蛋白的ATP酶活性测定

首先根据ATPase/GTPaseELIPABiochemKit说明书绘制磷酸根标准曲线.将1mLELIPA反应溶液、12.5μLELIPA试剂2、240μLELIPA试剂1、80μL合成微管和10μLTaxol(2mmol/L）混和后，按每孔147.5μL混合液的量在96孔板中分装，向每孔中加入1μg纯化的Kif18A-EE或Kif18A-AA蛋白，每种蛋白设置3个重复.以不加目的蛋白为空白对照，用洗脱液补齐.设置好分光光度计参数，在加入ATP前预先测定2组吸光度值.用排枪移液器同时向混合液中加入10μLATP溶液，立刻置于分光光度计中测定不同孔的360nm处的吸光度值（OD360），每1min测1次，连续测量1h.处理数据，绘制ATP酶活性曲线.

1.4数据处理

将测得的3组OD360取平均值，用目的蛋白的OD360减去空白对照的OD360，根据磷酸根标准曲线计算出差值对应的磷酸根的物质的量.用加入ATP后的磷酸根物质的量减去加入ATP前的数值，得到目的蛋白水解ATP产生的磷酸根物质的量，分别根据2种蛋白对应的磷酸根物质的量绘制ATP酶活性曲线.

2、结果与分析

2.1质粒pFastBac-Kif18A-EE和pFastBac-Kif18A-AA的构建与鉴定

用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切pEGFP-Flag-Kif18A-EE、pEGFP-Flag-Kif18A-AA、pFastBac-HTa质粒后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示.pEGFP空质粒大约为4800bp,Kif18AcDNA长度为2697bp，因此电泳前面的条带为Flag-Kif18A-EE和Flag-Kif18A-AApFastBac-HTa质粒长度为4855bp，与DNAmarker进行比对，位置正确.

图1酶切3种质粒后的琼脂糖凝胶电泳检测

通过琼脂糖凝胶回收试剂盒得到Flag-Kif18A-EE、Flag-Kif18A-AA和pFastBac-HTa的线性DNA，电泳结果如图2所示.

图2胶回收后3种质粒的琼脂糖凝胶电泳图

通过T4连接酶16℃过夜连接，连接产物全部转化TransT1感受态细胞，过夜培养，挑取阳性克隆，液体培养.通过小提质粒试剂盒提取pFastBac-Kif18A-EE、pFastBac-Kif18A-AA质粒.质粒经过测序后与NCBI公布的序列进行比对验证.

2.2杆状病毒基因组的制备及验证

将pFastBac-Kif18A-EE、pFastBac-Kif18A-AA质粒分别转化至DH10Bac感受态细胞中，挑取白色克隆过夜培养，提取杆状病毒基因组.当目的基因插入到杆状病毒基因组中，如图3所示，会得到含有目的基因的重组杆状病毒基因组.使用转座位点上游存在的M13上游引物和目的片段中设计的下游引物进行PCR，可得到大小为3707bp的DNA片段.对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，条带大小与理论值相符，证明确实发生了转座，获得了重组杆状病毒的基因组.

图3重组杆状病毒基因组的验证

2.3杆状病毒的扩增及蛋白表达条件优化

将重组的杆状病毒基因组转染SF9细胞后，杆状病毒在SF9细胞中进行组装和增殖.当SF9细胞中的病毒过多时，杆状病毒就会从SF9细胞中释放，进一步感染其他的SF9细胞.但病毒扩增到一定程度后，可能会表达不完整的Kif18A蛋白，因此需要优化Kif18A突变体蛋白表达的病毒感染条件.以Kif18A-EE杆状病毒为例进行优化过程的描述.通过设置连续梯度的感染比例（1∶100,1∶500,1∶1000,1∶5000）感染SF9细胞进行蛋白表达，在表达时间（72h）一致的情况下，可以得到杆状病毒的最佳感染比例为1∶5000，如图4(a）所示，在此感染比例下未出现杂蛋白.如果无论何种感染比例都出现很多杂蛋白，则用1∶5000的感染比例感染SF9细胞，分别在36、48、60、72h收取细胞，通过WeaternBlot验证，得到蛋白的最佳表达时间为72h，如图4(b）所示.最终得到Kif18A-AA的最佳感染比例为1∶20000,Kif18A-EE的最佳感染比例为1∶5000，最佳表达时间均为72h.

2.4蛋白质的表达及纯化

按照2种杆状病毒表达目的蛋白的最优条件感染SF9细胞，收取细胞后通过蛋白印迹杂交实验验证所感染的SF9细胞大量表达了目的蛋白，结果如图5所示.

图4Kif18A-EE杆状病毒条件优化

图5杆状病毒表达蛋白的鉴定

由图5可以看出，SF9细胞表达的蛋白可以被特异性鼠抗Flag和兔抗Kif18A抗体识别，Kif18A-EE蛋白可以被特异性抗Kif18A-S674和S684位点磷酸化的抗体所识别，Kif18A-AA蛋白不能被这些磷酸化抗体识别.表明Kif18A-EE蛋白可以很好地模拟磷酸化的Kif18A蛋白，而Kif18A-AA蛋白模拟了非磷酸化的Kif18A蛋白.

随后利用FlagBeads纯化上述蛋白，纯化后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色后脱色，观察目的蛋白的纯化效果，结果如图6所示.纯化得到的Kif18A-EE和Kif18A-AA蛋白浓度分别为0.12μg/μL和0.10μg/μL.

图6Kif18A-AA和Kif18A-EE的蛋白纯化

2.5微管体外合成

Kif18A作为一种驱动蛋白，能够利用水解ATP释放的能量沿着微管向正极末端移动.Kif18A要发挥ATP酶活性，需要微管参与，因此必须进行体外微管合成.微管蛋白在GTP存在下倾向于聚合，但聚合的微管并不稳定，所以在合成微管的过程中加入Taxol.微管蛋白通过聚合，合成了相对独立的微管，如图7所示，在荧光显微镜下观察，可以看到发出绿色荧光的微管.

2.6ATP酶活性检测

Kif18A沿微管向正极移动会水解ATP，形成ADP和磷酸根，且每水解一分子ATP会生成一分子磷酸根，因此通过磷酸根的量可以得出被水解ATP的量，即被水解的ATP的量反映Kif18A的ATP酶活性.磷酸根在360nm处有自己的吸收峰，因此可以利用分光光度计测量360nm处的吸光度值从而得到磷酸根的量.通过磷酸根的物质的量及其对应的吸光度值，得到磷酸根的标准曲线，如图8所示.

图7微管体外合成

图8磷酸根标准曲线

利用纯化得到的目的蛋白和体外合成的微管，进行ATP酶活性检测.根据加入目的蛋白后磷酸根的吸光度值，由磷酸根标准曲线计算出Kif18A突变体蛋白水解ATP的量，得到Kif18A突变体蛋白的ATP酶活性，结果如图9所示.

图9Kif18A-AA和Kif18A-EE的ATP酶活性检测

由图9可以看出，非磷酸化的Kif18A(Kif18A-AA）的ATP酶活性进入平台期后数值均为3.47nmolPi，模拟CDK1磷酸化后Kif18A(Kif18A-EE）的ATP酶活性平台期数值约为2.72nmolPi，即Kif18A-EE蛋白的ATP酶活性低于Kif18A-AA蛋白的ATP酶活性，表明CDK1对Kif18A的磷酸化修饰降低了Kif18A的ATP酶活性.

3、讨论与结论

Kinesin-8家族在整个真核细胞有丝分裂过程中对于微管长度的控制具有重要作用.Kif18A作为Kinesin-8家族中的一员，在微管正极末端的作用存在争议：体外实验发现Kif18A能够作为微管解聚酶使微管的稳定结构解聚[12]，但也有研究表明，Kif18A不具有内在的解聚酶活性，而是通过阻止微管蛋白加到微管末端，进而阻止了微管的聚合和解聚[2].Kif18A对细胞周期中的染色体整列有很大的影响.染色体整列包括中板集合与形成最薄中期板（thinnestmetaphaseplate)2个过程.有研究[11]报道，Kif18A在细胞有丝分裂早期被有丝分裂蛋白激酶CDK1磷酸化，这种修饰可以被磷酸酶PP1去磷酸化，当Kif18A无法被PP1去磷酸化时，细胞有丝分裂过程就无法形成最薄中期板.这可能是因为磷酸化的Kif18A无法到达微管正极末端，从而无法降低微管的动态不稳定性.同时Kif18A被磷酸化后不影响中板集合的时间，但会延迟最薄中期板形成的时间，这可能是因为CDK1的磷酸化修饰影响了Kif18A的运动能力.虽然H覿fner等[11]应用细菌表达的Kif18A进行了ATP酶活性的测定，但是由于原核细胞表达的蛋白可能不具有正常的蛋白构象[13]，因而实验结果仍需进一步验证.本研究利用杆状病毒昆虫细胞表达系统获得了目的蛋白，这种真核表达系统能够使目的蛋白的免疫原性、ATP酶活性等与天然蛋白的生物活性基本相同.体外实验结果显示Kif18A-EE蛋白的ATP酶活性低于Kif18A-AA蛋白的ATP酶活性，表明CDK1对Kif18A的磷酸化修饰降低了它的ATP酶活性.这一结果预示着CDK1的磷酸化修饰作用通过影响Kif18A的ATP酶活性，进而影响其在微管上的运动能力，使其无法及时到达微管末端并控制最薄中期板形成的时间.CDK1磷酸化修饰调节Kif18A的ATP酶活性的机制仍不清楚，是通过影响Kif18A的结构还是与其他蛋白的结合能力，仍需继续深入探索.

苏春玉,周之春,朱长军.CDK1磷酸化修饰对驱动蛋白Kif18A的ATP酶活性的影响[J].天津师范大学学报(自然科学版),2020,40(03):12-17.

基金:天津市高校“十三五学科领军人才培养计划”资助项目(135205LJ24);天津市科技支撑计划重点资助项目(18YFZCSY00100);新疆维吾尔自治区科技支疆资助项目(2017E0263);天津师范大学应用开发研究基金资助项目(135202XK1708).