乳酸菌是具有低GC值，兼性厌氧或耐氧，不产孢子，可利用多种碳源产乳酸的一类革兰氏阳性细菌[1,2]。由于乳酸菌具有高安全性、强耐酸性、代谢产物及功能多样性的特点，广泛应用于食品[3]、燃料[4]、化学品[5]与药品[6]的生产。如何提高乳酸菌的生产性能已成为主要的研究热点之一。其中，应用乳酸菌基因编辑技术进行表达系统开发、代谢途径改造及合成生物学研究[7,8,9]等被锚定为技术关键。乳酸菌代谢过程中，除目标代谢途径外，尚存在大量支路代谢，既分散了能量流，又产生了各种副产物，极大的影响了目标代谢物的累积和产酸效率。通过敲除其支路代谢途径的关键基因，将能量流引向目标代谢途径，是提高产品产量与质量的有效方法之一[10,11]。同时，通过对乳酸菌目标代谢途径相关关键基因的敲除，可解析相关基因的功能，探明代谢调控机制，提高菌体目标代谢物的产量[12]、提高其抗逆性[13]、拓宽其营养物质利用范围[14]，有效地简化生产工艺，降低生产成本。因此，基因编辑技术在乳酸菌的研发中，十分重要。自20世纪80年代后，出现了一系列基于同源重组的基因组靶向修饰技术，之后又出现了锌指核酸酶技术、类转录激活因子核酸酶技术和成簇规律间隔短回文重复)技术[15,16,17]。上述基因改造技术已广泛应用于大肠杆菌、酿酒酵母等模式微生物[18,19]。乳酸菌基因编辑方面的应用略少，但也有了一定程度的发展[20,21]。

1、乳酸菌基因靶向修饰技术

基因靶向修饰是利用特定工具与方法对目的基因或特定染色体序列进行定点修饰改造，从而达到改变遗传特性的目的。自20世纪80年代基因改造技术出现后，出现了多种多样的技术手段，根据其原理的不同，可大致分为两类:一类为经典的同源重组基因敲除技术，利用同源核酸序列之间会发生同源重组，从而达到对目的序列定点改造。根据重组酶的种类及来源、同源重组方式的差异可分为:RecBCD同源重组、位点特异性重组、线性DNA重组;另一类为基因组编辑技术，利用核酸酶对特定位点进行剪切，再通过同源重组)或非同源末端链接修复切断的序列，完成核酸序列定点修饰，CRISPR为该类技术中最具前景的基因编辑手段。

2、基于RecBCD同源重组的乳酸菌基因修饰

基于同源重组的乳酸菌基因靶向修饰技术是基于宿主菌自身的同源重组途径建立的，该途径需要多种酶共同作用，核酸外切酶V(exonucleaseV,RecBCD)和重组酶A(recombinaseA,RecA)是其中关键酶:RecBCD是由RecB、RecC、RecD三个亚基组成的蛋白质复合体，能够解开DNA双链，并形成单链，RecA酶能够识别同源序列并在RecBCD及其他酶辅助下，实现链交换，完成同源重组[22,23]。同源重组整个过程分为前联会体阶段、联会体形成阶段和Holiday结构的拆分阶段。RecBCD会降解线性DNA，故该基因改造策略通常会将靶基因上下游同源序列或不完整的靶基因序列整合到质粒上，构建出重组载体，转入宿主菌，敲除或敲入靶基因。根据同源重组次数分为单、双交换同源重组。单交换同源重组是指经过一次同源重组，将重组载体整合到宿主菌染色体上，破坏靶基因(图1)。许多科研工作者应用单交换同源重组做了大量工作，如:Leenhouts等[24]将自杀质粒(无法在宿主菌内自我复制的质粒)pHV60整合不同乳酸乳球菌同源序列，转入宿主菌，通过单交换成功将该质粒整合到宿主菌基因组不同位置，证明了单交换重组策略失活靶基因在乳酸菌上的可行性。Leloup等[25]利用pBluescriptSK质粒构建敲除载体在清酒乳杆菌(Lactobacillussake)上完成单交换同源重组，敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ptsI与β-半乳糖苷酶基因lacL，探明了乳酸菌中ptsI基因和lacL基因的功能。Lokman等[26]应用单交换同源重组技术对戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)木糖调节蛋白基因xylR及分解代谢物控制蛋白基因CcpA进行敲除，明确了上述两个蛋白对宿主菌木糖代谢途径的调控原理。

单交换同源重组要求简单，操作难度低，但会在染色体中引入抗性基因，难以去除，影响蛋白表达。为解决这一弊端，开发出了双交换同源重组改造技术。双交换同源重组改造技术是在单交换的基础之上，再进行一次同源重组，将带有抗性基因的重组载体从宿主染色体置换下来，达到无痕敲除的目的，提高安全性。双交换同源重组即可以达到无痕敲除(图2)，还可以在上下游同源臂之间插入新基因(图3)。Nierop等[27]改造pUC18，利用双交换策略，成功敲除植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)中Mn2+转运酶相关基因mntA、mtsA与mntH2，了解了上述基因与植物乳杆菌超高水平Mn2+积累的关系。

图1单交换同源重组

图2双交换同源重组敲除

双交换基因修饰技术的改造效率受自杀质粒调控。自杀质粒无法在宿主菌内复制，当质粒转化效率低时，会严重影响重组效率[28]。为提高重组效率，Law等[29]改进了实验方法，使用pORI质粒(该质粒能在有repA基因的大肠杆菌中自我复制，在无repA基因的乳酸菌中无法复制)构建重组载体，转化到含有温敏型质粒pVE6007(含有repA基因，30℃稳定复制，37℃无法复制)的乳酸菌中，先低温培养使重组载体大量复制提高同源重组几率，再高温培养，筛选出完成第一次单交换的菌株，接着再转入pVE6007，通过低温与高温培养，筛选出完成双交换中的突变菌株。温敏型质粒的低温复制、高温失活特性能够有效提高同源重组效率，一系列乳酸菌温敏型质粒被开发出来。Maguin等[30]使用化学诱变的方法，从一株含有pGK12质粒的乳酸乳球菌中筛选出具有温敏型质粒pVE6002(28℃稳定复制，37.5℃无法复制)，构建出了温敏型载体pVE6004(pG+host4)。Biswas等[31]在此基础上通过将pBR322复制区序列整合到pG+host4上构建出pG+host5载体，使其在大肠杆菌中37℃能够复制，易于获得大量质粒。随后将pG+host5用于乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)基因改造，发现同源序列长度从356到2552bp，长度越长，同源重组效率越高，超过这个范围，不再增加。Neu等[32]构建了35℃稳定复制，42℃无法复制温敏型质粒pTN1。Russell等[33]构建了37℃稳定复制，43℃不稳定的温敏型质粒pTRK。单双交换同源重组由于理论机制清楚、适用性广、研究较多，是目前乳酸菌基因改造的主要方法[34,35,36,37,38]。但该方法存在同源臂长，重组效率高，但构建困难;同源臂短，则重组效率低，筛选耗时繁琐，工作量大。

图3双交换同源重组基因整合

3、基于位点特异性重组的乳酸菌基因修饰

位点特异性重组发生在特定DNA序列之间，在重组酶的作用下，识别并切割特定DNA序列，实现链交换，完成重组[39]。由于位点特异性重组只发生在特异性位点之间，因此重组效率高，适用性广，广泛应用到多种生物的基因修饰当中[40,41,42,43]。位点特异性重组会因为特异性位点的方向与序列方向的差异而产生不同的重组结果，切除、整合与倒位[44,45](图4)。

图4位点特异性重组

Campo等[46]利用来自于大肠杆菌噬菌体P1的Cre/loxP位点特异性重组系统对乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)进行基因修饰。该系统由特异性位点与特异性位点重组酶两部分组成:由位于两端的两个13bp反向重复序列与中间8bp的间隔序列构成loxP位点，能够识别loxP位点并切割DNA序列完成重组的Cre重组酶。诱导温敏型质粒pGhost9表达Cre重组酶，实现基因敲除与倒位。该方法成功建立了一种乳酸菌基因改造方法，但会留下loxP位点，影响下一次基因改造。于是Lambert等[47]对Cre/loxP系统进行了改进，通过双交换同源重组将lox66与lox71位点整合到染色体后，表达Cre酶，完成重组后这两个位点会形成退化的识别位点lox72，该位点无法被Cre酶识别，不影响下一次的基因改造(图5)。Zhu等[48]应用同样方法，敲除了乳酸乳球菌中的胸苷酸合成酶基因thyA，成功构建了食品级筛选标记菌株。Xin等[49]将使用loxP位点的传统同源重组系统与lox66、lox71位点的Cre/loxP系统相结合，在干酪乳杆菌中实现了大片段基因敲除，该方法单次敲除最长可达39.3kb。

位点特异性重组基因修饰能够在对基因改造的同时，不引入抗性基因，避免了抗性基因的存在对上下游基因表达的影响，安全性好，重组效率高且适用性广，能够在多数乳酸菌中进行改造。但该方法还是会在染色体上留下一个识别位点，识别位点整合到染色体上仍需要借助传统的同源重组方法，无法避免同源重组效率低的问题，需要与其他方法结合来弥补其不足。

图5基于lox66与lox71位点的Cre/loxP系统基因改造

4、基于线性DNA重组的乳酸菌基因修饰

传统同源重组基因修饰与位点特异性重组基因修饰都需要构建载体，通过同源重组将改造元件整合到染色体上，操作繁琐，工作量大。因此，基于重组工程的线性化DNA重组基因改造得到广泛关注[50,51,52,53]。重组工程是一种利用噬菌体编码重组酶完成DNA改造与重组的基因工程手段，因其起源于针对λ噬菌体重组酶基因(exo与beta)及Rac前噬菌体重组酶基因(recE与recT)的研究，所以又称为Red/ET重组系统[54]。Beta与RecT同为单链结合蛋白，能够结合单链DNA完成同源重组，Exo与RecE具有核酸外切酶活性，能够将双链DNA转变成单链DNA，并协助Beta与RecT结合到单链DNA上，相对于微生物自身的RecBCD重组系统更加高效[55]，且能够抑制宿主菌自身的RecBCD蛋白表达，防止外源DNA被降解[56]，因此该系统不需要构建载体，只需线性化的DNA即可，且同源臂长度只需50bp，较传统同源重组更方便[57]。根据使用的线性化DNA的不同，可分为单链DNA重组与双链DNA重组(图6)。

Yang等[58]利用植物乳杆菌自身前噬菌体P1中Lp-0640,Lp-0641和Lp-0642重组酶，将线性化双链DNA转入植物乳杆菌中，成功对目的基因进行敲除。但该方法由于该酶具有局限性，只能在植物乳杆菌中起作用，而无法在其他乳酸菌中起作用。单链DNA重组工程在乳酸菌中应用更有前途，Datta等[59]从粪肠球菌中分离出单链结合蛋白RecT，使单链DNA重组工程在乳酸菌中应用得到实现。VanPijkeren等[60]利用利用单链DNA对乳酸乳球菌和罗伊氏乳杆菌中的目的序列进行改造，提高了宿主菌对万古霉素的敏感性[61]。该技术所需同源序列短，操作简单，效率高，但乳酸菌菌种之间存在显著差异性，如何获得一种在乳酸菌中有效且适用性广的重组酶系统仍是一个关键问题。

图6单双链重组改造

5、基于CRISPR/Cas系统的乳酸菌基因编辑

CRISPR/Cas技术是近年深受关注的一种新兴的基因组编辑技术，在植物[62]、动物[63]与微生物[64]中均有应用。与前面介绍的基因编辑方法有所不同，前几种编辑方法基于重组酶与DNA序列“识别-结合-链交换-重组”过程不同，该技术是基于DNA断裂/修复过程实现对目的序列的编辑[65]。CRISPR/Cas系统是微生物中的一种噬菌体免疫机制，当噬菌体或外源DNA序列入侵时，能够保留其中一部分序列，在下一次入侵时使用保留的序列进行识别并对其进行剪切与消灭[66]。CRISPR/Cas系统分为三类，由于Ⅰ型与Ⅲ型需要多种蛋白共同作用，而Ⅱ型只需要一种蛋白即可[67](Cas9蛋白就是其中一种)，这为广泛利用提供了基础。以CRISPR/Cas9系统为例，由以下三部分组成:具有回文结构及发卡结构，高度保守的重复序列与具有噬菌体或外源序列的间隔序列共同构成的间隔重复序列;表达Cas(CRISPR-associated)蛋白的基因序列;前间区序列邻近基序。CRISPR/Cas9系统敲除流程如下:Cas蛋白表达，间隔重复序列转录并经过剪切形成crRNAs，与tracrRNAs形成复合体(后经改造为gRNA)结合到Cas蛋白上，在crRNAs-tracrRNAs复合体引导Cas蛋白识别PAM位点，结合到染色体上，寻找靶序列切割DNA形成双链断裂，通过同源重组或非同源末端链接修复[68,69](图7)。在有模板的情况下通过HR方式修复可实现基因敲除与插入，在无模板的情况下通过NHEJ修复可实现随机突变。在原核生物中由于没有NHEJ修复机制，可利用该方法作为敲除中的反向筛选[70]。

图7CRISPR/Cas9基因编辑[71]

Sanozky-Dawes等[72]在加氏乳杆菌中发现了一种自身存在的Ⅱ-A型CRISPR/Cas系统，并对其CRISPR相关基因、间隔区与PAM等进行了研究，证实该系统在乳酸菌上应用的可能性。JeeHwan等[73]利用CRISPR/Cas9系统筛选recT介导的单链DNA重组后产生野生型菌株，利用CRISPR会产生DNA双链断裂，使野生型菌株致死，提高了敲除后的筛选效率;Jang等[74]将CRISPR/Cas9系统应用到明串珠菌上，成功将难以去除的隐形质粒pCB42从宿主菌中移除，为菌种后续改造留下良好的基础;Song等[75]利用CRISPR-Cas9D10A对加氏乳杆菌进行基因编辑，成功敲除一个胞外多糖生物合成基因和两个尿嘧啶磷酸酶基因，突变效率可达到65%,9天内可以完成整个流程。Crawley等[76]通过分析1262种乳酸菌基因组信息，发现普遍存在CRISPR/Cas免疫迹象存在，CRISPR/Cas系统Ⅱ型尤其是A类亚型在自身乳酸菌宿主中表现活性，能够有效对外源及宿主DNA进行编辑，为之后CRISPR/Cas系统在乳酸菌中的应用提供了更多的选择。虽然目前CRISPR/Cas对乳酸菌基因组编辑的实例较少，但由于其实验要求低，操作简单快捷，随着研究的进一步发展，CRISPR/Cas系统在乳酸菌基因编辑方面必将得到广泛应用。

6、结论

乳酸菌作为一种公认的安全微生物，广泛应用于食品、医药、化学品生产等各方面。目前，乳酸菌基因敲除、改造仍是以传统同源重组为主，工作量大，效率低，急需加大研究力度。此外，乳酸菌种间差异较大，基因编辑工具的通用性也是一个普遍存在的问题。将多种编辑工具结合进行基因编辑，已成为一种有效的解决策略，可以将彼此优点结合，缺点互补，从而提高基因编辑的精确与效率。在各种基因编辑技术中，CRISPR/Cas9技术凭借着简单、快速、效率高的特点吸引许多研究者的关注。随着对CRISPR/Cas系统在乳酸菌中工作机制与结构特点的深入研究，将成为乳酸菌下一代主流基因编辑技术。

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基金:吉林省科技厅自然科学基金(17MY057Z);吉林省科技厅重点研发计划(2020042097NC)资助项目;吉林省秸秆科技创新平台项目[(2014)C-1];长春市科技局地院合作项目(17DY015).