急性肺损伤（Acute lung injury,ALI）是一种临床常见危重病，死亡率较高[1]，典型病理改变为弥漫性炎性损伤、呼吸膜和血管等组织结构破坏[2]。ALI后肺部组织会发生成纤维细胞聚集、胶原沉积等纤维增生反应，最终形成肺间质纤维化[3]。研究报道，肺纤维化是2019年新型冠状病毒肺炎（COV⁃ID-19）重症患者的后遗症[4,5]。新冠疫情以来，以甘肃道地药材为主药的“甘肃方剂”系列方，控制了新冠肺炎重症、危重症的发生率[6,7]。甘肃省新冠肺炎防治中医药专家组在清肺排毒汤的基础上合以化瘀通络之药，形成了治疗重症COVID-19的清肺通络方[8]。该方可有效治疗处于疾病中期的新型冠状病毒肺炎患者[8,9]。内毒素是临床上导致ALI的主要病因之一，本研究以脂多糖（Lipopolysaccha⁃ride,LPS）诱导建立大鼠急性肺损伤模型，通过清肺通络方干预治疗，观察大鼠ALI后早期肺纤维化程度，探讨清肺通络方对ALI后肺纤维化的抑制作用。

1、实验材料

1.1实验动物

SPF级成年SD雄性大鼠（体重200±10g）购于中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心[许可证号：SCXK（甘）2020-0002]，在标准条件下的笼子中饲养大鼠，温度控制在22～25℃，相对湿度控制在50%～60%，水和食物自由获取，12小时明暗交替。本研究的动物饲养和实验操作符合动物福利和伦理原则，经甘肃中医药大学实验动物伦理委员会批准（审查批准编号：2023-471）。

1.2试剂和仪器

大鼠IL-1β、TNF-αELISA检测试剂盒（上海优选生物科技有限公司），苏木素-伊红（Hematoxy⁃lin-Eosin,HE）染液（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司），脂多糖（LPS）（北京索莱宝科技有限公司）、Masson染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），离心机（型号TDZ4-WS，上海卢湘仪离心机仪器有限公司）、酶标分析仪（型号DNM-9602，北京普朗新技术有限公司），织脱水处理机（德国SLEE），半自动石蜡切片机（德国SLEE），自动组织包埋机（德国SLEE），显微镜（日本OLYPUS）。

1.3清肺通络方

“甘肃方剂”清肺通络方选用中药免煎颗粒剂，河西学院第二附属医院智能中药房提供，该方[5]由蜜麻黄9g、杏仁9g、生石膏20g、胆南星6g、葶苈子15g、桃仁9g、赤芍15g、射干9g、生薏苡仁6g、水蛭3g组成。用去离子水水溶解中药颗粒，配制为药物浓度为三种不同规格：0.5g/ml、1.0g/ml和1.5 g/ml。按人鼠体表面积计算公式，大鼠低剂量给药量（g·kg-1）=人日用量110g÷60kg×6.25，中、高剂量为低剂量的2倍和3倍，得出低、中、高剂量分别约为10、20、30g·kg-1，药物均当天现配现用，用量为0.2ml/20g。地塞米松磷酸钠注射液5mg/ml（贵州天地药业有限责任公司，批号21011202A）。

2、实验方法

2.1动物分组、造模和药物干预

30只雄性SD大鼠按体重均衡原则随机分为6组，空白组，模型组，地塞米松组，清肺通络方低、中、高剂量组，每组5只。采用气管内滴注、腹腔注射和气管内滴注LPS三击方案造模[10,11,12]。先经口气管注入含1.5mg/kg LPS的生理盐水溶液，24h后腹腔内注入含3mg/kg LPS的生理盐水溶液，48h后再经口气管注入含3mg/kg LPS的生理盐水溶液，而空白组注入等量生理盐水。清肺通络方低、中、高剂量组先给与相应剂量的清肺通络方灌胃，空白组、模型组、地塞米松组用等剂量的蒸馏水灌胃，预处理3d，第4d开始造模，在造模过程中和造模后各组连续再灌胃7d，地塞米松组用5mg/kg地塞米松灌胃。

2.2标本采集与处理

在最后1次给药12h后，使用50mg/kg戊巴比妥钠将大鼠麻醉，心脏采集血液分离，离心取血浆在-20℃冰箱冷冻保存，随后处死大鼠，取右肺上叶称重获取湿/干比，取右肺中叶用10%中性甲醛溶液固定，取右肺下叶在-80℃冰箱冷冻保存。

2.3观察肺组织病理学形态

右肺中叶肺组织在10%甲醛固定后，在乙醇和二甲苯中进行脱水处理，包埋在石蜡中，切成4μm切片，然后进行HE染色和Masson三色染色，光镜下（×200）观察肺组织病变情况并拍照，Masson染色光镜下胶原纤维呈蓝色，肌纤维、胞质、纤维素、角蛋白和红细胞呈红色，胞核呈蓝褐色。

2.4 ELISA法检测血浆中IL-1β、TNF-α的表达水平

检测按ELISA试剂盒说明书测定各组大鼠血浆中IL-1β和TNF-α的含量。

2.5统计方法

采用SPSS 24.0统计学软件进行数据分析，GraphPad Prism 8.0软件进行图片制作。所有数据均以均数±标准差表示，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1清肺通络方对LPS诱导的大鼠肺组织形态改变的影响

各组大鼠肺组织HE染色结果显示（图1），空白组肺泡腔及肺泡隔结构完整，水肿及炎症反应较轻，未发现出血现象。模型组肺泡腔及肺泡隔结构模糊，肺泡隔厚度增加呈充血、水肿、部分肺泡隔纤维增殖明显，肺泡腔里有大量炎性细胞浸润和水肿液，甚至可见出血现象，大部分肺泡出现塌陷，部分可见融合成肺大泡。地塞米松组和清肺通络方各组（10,20,30g·kg-1）肺组织可见充血、水肿，但明显较模型组好转，病理损伤程度明显改善，水肿程度降低，纹理较清晰，肺泡间隔存在局部变厚，肺泡较少存在融合。清肺通络方可显著改善LPS诱发的大鼠肺纤维化的病理组织变化。

图1光镜下各组大鼠肺组织病理改变（HE染色，×20）

图①为空白组大鼠肺，图②为模型组大鼠肺，图③为DEX组大鼠肺，图④为低剂量组大鼠肺，图⑤为中剂量组大鼠肺，图⑥为高剂量组大鼠肺。

3.2清肺通络方对LPS诱导的大鼠胶原沉积的影响

各组大鼠肺组织Masson染色结果显示（图2），空白组大鼠肺组织在气管及血管壁周围可见少量蓝色的胶原纤维沉积。模型组大鼠肺组织中可见大量被染成蓝色的胶原纤维沉积区域，纤维化程度最高。清肺通络方各组大鼠肺组织出现部分染成蓝色的区域，纤维化程度介于空白组及模型组之间。地塞米松组大鼠肺组织仅有少量的区域被染成蓝色，纤维化程度最轻。上述结果表明，清肺通络方可缓解LPS诱导的ALI大鼠肺组织损伤和肺纤维化所致的胶原沉积。

图2光镜下各组大鼠肺组织病理改变（Masson染色，×20）

图①为空白组大鼠肺，图②为模型组大鼠肺，图③为DEX组大鼠肺，图④为低剂量组大鼠肺，图⑤为中剂量组大鼠肺，图⑥为高剂量组大鼠肺。

3.3清肺通络方对ALI大鼠血浆中TNF-α和IL-1β表达水平的影响

与空白组比较，模型组大鼠血浆中炎性因子IL-1β和TNF-α表达水平均升高（P<0.05）；与模型组比较，地塞米松组，清肺通络方各组大鼠血浆中IL-1β和TNF-α表达水平均降低（P<0.05）；与地塞米松组比较，清肺通络方各组大鼠血浆中IL-1β和TNF-α表达水平均降低，地塞米松组与低剂量组IL-1β表达水平无统计学差异（P>0.05），地塞米松组中剂量和高剂量组IL-1β表达水平有统计学差异（P<0.05），地塞米松组与清肺通络方各组TNF-α表达水平均无统计学差异（P>0.05）；清肺通络方低、中、高剂量组两两比较，TNF-α表达水平依次升高，组与组之间无统计学差异（P>0.05），清肺通络方低剂量组与中、高剂量组IL-1β表达水平有统计学差异（P<0.05），清肺通络方中剂量组与高剂量组IL-1β表达水平有统计学差异（P<0.05）。上述结果表明，总趋势是清肺通络方可降低LPS诱导的ALI大鼠血浆中IL-1β和TNF-α表达水平，且与清肺通络方剂量关系不大。详见表1和图3。

表1各组大鼠血浆中TNF-α和IL-1β表达水平（±s n=5)

图3各组大鼠血浆中IL-1β和TNF-α水平（±s n=5)

4、讨论

ALI是包括新冠肺炎在内的很多疾病的共同病理过程，其特征是“炎症反应风暴”和肺部纤维化[12,13,14]。ALI后早期肺纤维化阶段是ALI的关键病理过程[15]，是ALI患者预后不佳的重要影响因素[16]。研究报道，肺纤维化是2019年新型冠状病毒肺炎（COVID-19）重症患者的后遗症[4,5]。新冠疫情以来，以甘肃道地药材为主药的“甘肃方剂”系列方，控制了新冠肺炎重症、危重症的发生率[6,7]。清肺通络方是“甘肃方剂”治疗重症型COVID-19的方剂，清肺通络方对ALI后的肺纤维化是否有抑制作用，目前未见文献报道。本研究采用气管内滴注、腹腔注射和气管内滴注LPS三击方案诱导大鼠ALI模型，观察大鼠ALI后早期肺纤维化程度，探讨清肺通络方对ALI后肺纤维化的抑制作用，为进一步探究该方治疗重症型COVID-19的现代医学药理作用机制。

LPS是肺部急性感染性损伤模型的常用诱导手段，是革兰氏阴性菌细胞壁的重要组成部分[17],LPS进入体内后促使中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞在肺组织中募集和活化，释放大量炎症因子，引发炎症级联反应，形成“细胞因子风暴”最终导致肺组织损伤[18]。因此，抑制“细胞因子风暴”形成可能是治疗ALI的关键。在众多的细胞因子中TNF-α和IL-1β是ALI发生发展过程中肺组织局部产生的最具代表性的促炎因子[19]。TNF-α是ALI病程发展中的“急先锋”，也被认为是COVID-19高度炎症病理成因中的主要“罪魁祸首[20]。IL-1β水平升高被认为是肺组织的炎症信号[21]。本研究结果表明模型组大鼠血浆中炎性因子IL-1β和TNF-α表达水平高于空白组（P<0.05），与文献报道基本一致。清肺通络方（10,20,30g·kg-1）和地塞米松（5mg/kg）干预后大鼠血浆中IL-1β和TNF-α表达水平均低于模型组（P<0.05），说明清肺通络方可逆转这种炎症因子异常增多的情况，是清肺通络方缓解LPS诱导的ALI的机制之一。

肺纤维化是导致肺功能受损的关键，其病理过程主要包括早期损伤、炎症反应、成纤维化3个阶段，肺纤维化起源于肺损伤并伴之发展，因此在ALI早期实现肺纤维化形成干预，可有效的延缓及控制肺纤维化的形成[22]。本研究采用三击方案造模，脂多糖刺激7天，Li Hui等[23]在LPS三击方案诱导ALI中发现，LPS刺激后3～7天为第一个快速肺纤维化阶段。本研究属于ALI的早期阶段，是药物干预的最佳时期。通过肺组织形态学观察，HE染色检查显示模型组肺泡腔及肺泡隔结构模糊，肺泡隔厚度增加，部分肺泡隔纤维增殖明显，大部分肺泡出现塌陷，部分可见融合成肺大泡。地塞米松组和清肺通络方各组肺组织病理损伤程度明显较模型组减轻，肺泡腔及肺泡隔结构尚存，肺泡间隔存在局部变厚，肺泡较少存在融合。Masson染色结果显示模型组大鼠肺组织中可见大量被染成蓝色的胶原纤维沉积区域，其纤维化程度相较于地塞米松组和清肺通络方各组明显增加，地塞米松组大鼠肺组织仅有少量的区域被染成蓝色，纤维化程度最轻，地塞米松组和清肺通络方各组其纤维化程度与空白组相比无明显差异或差异较小。这都说明清肺通络方对LPS诱导的ALI后肺纤维化有抑制作用。

综上，清肺通络方能明显降低ALI大鼠血浆炎性因子水平，抑制ALI后早期肺纤维化程度，为临床治疗ALI和预防肺纤维化提供了新的选择和研究途径，但其防治机制还需进一步深入研究。

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基金资助:2021年甘肃省高等学校创新基金项目(2021A-119); 2022年甘肃省科技计划资助项目(22JR5RG571); 2022年甘肃省高等学校创新基金项目(2022B-179); 2022年甘肃省大学生创新创业训练计划项目(S202210740112); 2023年甘肃省高等学校创新基金项目(2023B-166);

文章来源:张娟娟,刘亚宁,孙超,等.清肺通络方对急性肺损伤后大鼠肺纤维化的影响[J].河西学院学报,2024,40(05):21-26.