1、概述

依据微生物生长情况对结果作出评判的无菌检查法至少需要14 d的培养周期(见<71>无菌检查法)，该法不适用于那些短货架期产品或即制即用产品，即在无菌检查结束前已被使用的产品。这些短货架期产品，包括复合无菌制剂(CSPs)、正电子发射层析显像产品(PET)、细胞和基因治疗产品等，需要新一代依据风险评估的检查方法，这类方法涵盖快速微生物检查法。除无菌检查法外，有助于保证无菌的一般性论述，见<1211>无菌保证。应注意的是，就替代方法来讲，当出现争议事件时，仲裁方法为<71>无菌检查法。

如需进行微生物污染检查，应在产品使用前完成检查，尽最大可能保证患者安全。

快速微生物检查法(RSTs)是依据于风险评估的，因此需要根据预期用途和用户需求，评估获得结果的时间、专属性、检测限、取样量和产品属性等参数。例如，许多放射性药物由于放射性的半衰期短，最好采取实时微生物检查的方法;复合无菌制剂和细胞治疗产品，由于使用前的时限短，故需在过夜时限内或者至少在48 h内完成检查。

本章讨论了生产商、短货架期产品的制备和检查、用户需求的内容，并简述了基于风险的微生物快速检查法在无菌短货架期产品(本章以下简称“短效期产品”)放行中的应用。

2、无菌短效期产品放行的快速微生物检查法的客户需求

选择适宜的技术对短效期产品进行快速微生物检查是依据风险评估的决策。不同技术的用户需求包括:

在尽可能短的时间内获取结果，如理想状态下的实时或少于24 h，最好是在产品使用前完成;

检测能力应更适用于少于100 cfu的产品;

大范围检查产品内存活微生物的能力;

无需使用大量的样本如产品检查的最少数量和每个容器内的产品检查量;在可行的情况下，生产商应在工艺设计过程中考虑检查的要求;

无菌检查时产品的处理(如使用封闭系统以减少检查中无意的污染);

众多厂商设备和试剂的有效性;

参考标准的有效性，阴性和阳性的对照，适用除cfu以外的信号技术;

易于使用/检查且数据分析简洁;

低的假阳性和假阴性率;

每个专属产品均有方法适用性评估;

产品使用前完成检查、实验能够提供无菌检查失败后的进一步检查和报告等，可提高患者的安全性;

识别检查到的微生物能力(对临床医生使用产品和调查确定其污染微生物来源是有价值的);

检查所用设备和试剂的稳定性和可靠性;

样品的制备适用于人工和自动化方法。

3、依据风险评估的微生物监控和放行检查的概念

对快速微生物检查的客户需求的研究表明，需要做出一些依据风险评估的决策，特别是在以下方面:获得结果的时间、检测限、取样量和微生物检测范围，使这些检查能在产品使用前完成。如果现行药典的无菌检查法不适用，应对所选快速微生物检查法进行风险评估。

快速微生物检查法包括以下优点，例如:

由于产品使用不及时而造成患者存活有重大风险时，需使用快速微生物检查法。来自临床一个显著的病例是体内循环血液的感染会加快侵染，使死亡率上升至40%，抗生素的应用每延迟1天会导致死亡率增加10%。在这些病例中，先于使用前完成微生物检查，能显著提升患者的安全性;

使用依据微生物生长的快速微生物检查法，在风险放行中可连续读取“阴性数据”，故可更早的检查出污染微生物。如果检查异常也能够让临床医生迅速对患者进行干预治疗。当检查到污染产品时，实验室管理者能够通知临床医生对患者采取治疗，使用血管内液复原和抗生素治疗以避免感染性休克。因此，与培养时间结束后获得的结果相比，时时监控和自动报告异常情况的无菌检查法具有额外的优势;

使用非生长方式的快速微生物检查法，检测限在1 cfu以上，可通过微生物培养基的生长增殖，快速获得结果。其污染检出、及时性、在短效期产品使用前完成检查的能力，被认为比检出产品中单菌落的能力更为重要。当考虑到患者的风险时，快速微生物检查法的选择应该涉及到试验的灵敏度和检查时限。在检查低水平污染物时，试验应具有适宜的灵敏度，并在产品使用前的一定时间范围内获得结果;

非生长方式的快速微生物检查法的其它优点，包括检查能力不受样品所含抗生素的影响和可以检测到培养法结果阴性但样品中含有的致病原。已有研究表明，一些DNA靶向抗生素(例如，多粘菌素B和杆菌肽)对PCR扩增有抑制作用，而青霉素G、氯霉素、两性霉素、萘啶酸等抗生素则无抑制作用。这对无菌复合药房所配制注射用抗生素的检查方案选择是非常重要的。方法适宜性应确定受检样品中的任何抗生素是否会影响检查。

此外，可以使用快速微生物检查法或其它快速微生物方法作为过程控制，在终产品的无菌检查完成前放行，在微生物控制的有效性上提供快速信息、早期的总污染检查(能够调查和快速重启生产)或产品无菌失败的概率。

对于风险评估，可能忽视的一个因素为对患者的相对风险是基于注射或注入产品的体积和给药部位。体积越大、进入身体部分越多，对患者的血液感染风险越高。从小体积的注射到大体积输入风险等级的范围见表1。

表1给药途径的典型剂量和相关风险等级

4、依据风险评估的快速微生物检查法用于无菌短效期产品放行的关键操作参数

预估的运行参数，即适用于快速微生物检查备选技术的检测限、获得结果的时间、取样量，见表2。

表2备选快速无菌检查技术的运行参数

5、<71>无菌检查法不适用于产品放行的情况

5.1样本量的考虑

根据不同技术处理样品的能力或留存急需产品的需求，可能需要尽量减少检查的样本量。

每种培养基对应的产品最小检验量和相对于每批次量的最小检验单位，可以见表3和现行<71>无菌检查法的表3。对于大批量的药品，检查数量并不是基于统计的，而且在单个产品批次中检查出低污染水平的能力较低。但随着许多短效期产品更小批量的出现，这一限制将会减少，因为检查产品的比例相对于批量将会增加。

传统取样方案不适用于细胞制品。例如，制备10个静脉注射袋，其中分别含60 m L细胞制品，其中4个静脉注射袋被分别取样20 m L。每批次的40%被用于无菌检查，这不仅会造成是巨大的经济损失，更会消耗大量治疗产品，从而导致用于患者治疗所需的剂量不足。与此相反，如果40 000瓶批次的注射用药品，取1 m L/瓶的40瓶用于检查，这将仅占批次的0.1%。

减少取样量和检查数量将降低无菌检查的灵敏度。表3和表4说明了药品和复合无菌制剂在检查中的相对不敏感性。

表3 20个单位药品增加污染率后的无菌检查通过概率

通过下面公示进行计算:p=(1-p)20=q20p=本批次中受污染容器的概率q=本批次中未受污染容器的概率

表4 6个单位复合无菌制剂增加污染率后的无菌检查通过概率

替代取样方案在其它药典中已有提及。欧洲药典9.0章节2.6.27细胞制品的微生物检查中涉及了单批量小于40单位的细胞制品无菌检查建议方法。

细胞制品的取样方案为，体积在10～1 000 m L的，取总体积的1%;体积在1～10 m L的取0.1 m L;体积少1 m L的制品无法检查。如《联邦法规21章》610.12条(无菌)中所建议的，在完全合理的情况下，可以使用快速的过程检查方法替代最终产品检查。

与细胞制品具有相似情况的正电子发射层析显像产品，取样数量和取样量的方案必须满足每批次产品的体积(通常不少于15 m L)和有限的瓶数(通常是1个)。如果批次由单个瓶组成，无菌检查取样数量至少为总批次量的1%。例如，批次由容量为15 m L的1瓶组成，无菌检查至少需要取0.15m L;批次由多于1瓶组成，从1个瓶中取至少1%的总批次体积为代表。批次由容量为25 m L的3瓶组成，至少需要从1个瓶中取0.75 m L进行无菌检查。

5.2检测限

使用含1 cfu或多cfu细胞悬液作为接种液时，依据微生物生长的无菌检查法根据泊松分布，理论检测限值可达至少1～3 cfu。对任何无菌检查来讲，利用任何技术来设定一个活细胞检测限都是不切合实际的，特别是检测信号不是通过培养基富集扩增后以cfu为依据的。

5.3广泛的微生物检测能力

虽然所有的分析平台均应具备检测大范围细菌、酵母菌和霉菌的能力，但证明所选的快速微生物检查法具备检出与导致无菌失败、感染暴发、产品(复合无菌制剂、放射性药物、细胞治疗、制造的药物)召回相关的微生物的能力，有重要的现实意义。如果在风险分析之后，这项技术被证明可以用于对利益相关者群体特有的产品进行检查以提高患者的安全性，那就更具有重要的现实意义了。

6、用于无菌短效期产品放行的快速微生物检查法

基于上述用户的需求，推荐适用于快速微生物检查的技术，按字母顺序排列如下:

三磷酸腺苷生物发光成像技术、流式细胞、等温微量热法技术、核酸扩增、呼吸作用、固相细胞计数。

6.1技术简介

对这些备选的高级分析平台分别进行了简要的讨论，并提供了关键的参考资料。

6.1.1三磷酸腺苷生物发光成像技术

这是一项成熟的技术。其原理为:活细胞的能量以ATP形式储存，当其接触美国萤火虫荧光素酶时可以反应发光，从而被检测。被荧光素酶消耗的每个ATP分子产生1光子。由光度计检测到的结果依赖于仪器，试剂和有机体，结果通常以相对光单位(RLU)表示。不同微生物的ATP含量为:革兰氏阴性菌为2～4×10-18mole/cfu，革兰氏阳性菌为5～8×10-18mole/cfu，真菌为300～800×10-18mole/cfu。考虑到测量的高信噪比和微生物培养基中的背景ATP，微生物相关仪器在肉汤中的检测限约为5 000 RLU，相当于103cfu。

该技术的检出限可检出存在微生物的数量等级比目视检测所需培养基中的生长数量等级低3～4个对数。可以使用液体培养基富集以达到阈值ATP水平，或在固体培养基的膜过滤器上培养2～7 d，以形成微生物菌落。

6.1.2流式细胞

流式细胞术可用于检测，富集培养24～48 h后荧光标记的活微生物细胞。标记试剂由荧光基质或活体染料组成，用于区分活细胞、死细胞和细胞碎片。虽然细菌很小，难以与细胞碎片区分开来，但可根据它们的大小、形态和荧光强度进行区分。细胞活力是指完整细胞膜保留荧光色素的能力，这些荧光色素由非特异性细胞酯酶或特异性核酸活性染料标记所产生。激光照射流中的每个细胞和发出的光由双光电倍增管阵列检测，信号经过数字化处理并由识别软件进行分析。该项技术的检测限可能会>1 cfu，因此可能需要一个富集的步骤。

6.1.3等温微量热法技术

恒温微热量计检测密闭小瓶(系统)中与微生物代谢活动和生长有关的焓变化。在现有仪器中，104个活微生物细胞可以释放出足够用于检测的热量，检测需要富集化培养(结果需要2～7 d)。近年来，人们对其在制药微生物学中的应用进行了评估，但其在无菌产品放行试验中的具体应用尚未确定。

6.1.4核酸扩增

实时定量聚合酶链反应(PCR)具有监测PCR扩增指数期的能力，使用通用引物和探针(称为全细菌和全真菌法)经36～48个扩增循环来估算模板DNA的初始量，模板DNA的初始量倒数与检测样本中微生物的量成正比关系。不同于DNA，细胞RNA在代谢中转化迅速，这将是一种更好的微生物生存指标。例如，大肠埃希菌的每个细胞含有2个DNA分子和2×104个16SrRNA分子。这一过程是通过逆转录酶将RNA转化为互补DNA(cDNA)的互补拷贝实现的，cDNA可以通过定量(计数试验)或定性(无菌试验)实时分析。另外，基于DNA的PCRs，经乙酰亚胺或丙烯酰胺对样品的预处理可以区分活的和死的微生物细胞，或可通过离心/洗涤步骤和用于分析的细菌感受态，从检测样品中去除游离的微生物DNA。

实际上，单个活细胞的检测限可能是一个无法克服的挑战，尤其对于依赖目标DNA/RNA和通用引物的试验。另一挑战是在不同微生物当中的基因组物质含量不同。

一般来说，检测限在样本中范围为每毫升10～1 000个活细胞，在一些报告的病例中范围为每毫升10～100个活细胞。最近的研究表明，在不需要预培养的情况下，每毫升含有106个哺乳动物细胞的高浓度样品中，PCR实际上可以检测到每毫升微生物为102～103cfu。增加至少24～48 h的生长富集步骤并比较培养前后的PCR结果，可能为无菌检查提供一种实用的解决方案。另一种方法是利用浓缩富集样品，减少样品体积。正如最近一项研究的作者使用16SrRNA PCR对干细胞进行无菌检查研究，证明了其灵敏为10～100 cfu·m L-1的细菌，100 cfu·m L-1灵敏度的检测方法将适用于检测血液和细胞产品的临床重大细菌污染。

依据微生物生长的检查法和依据核酸扩增的检查法很难直接进行比较，因为依据核酸扩增的检查法不能区分无法存活的生物体，仅是估算微生物基因组拷贝数，而不是菌落形成单位。因此，以核酸扩增为基础的分析，其检测限应根据每毫升基因组当量来定义。

非依据微生物生长的用于无菌短效期产品放行的快速微生物检查法，如核酸扩增，可能具有以下额外优势:

由于接近实时检测，检查将在短效期产品使用前完成;

检查培养阴性中的感染因子;

如本章前面所述，检查中抗生素对检测样品的影响最小;

由于特定的微生物基因是靶向的，因此与其它技术相比，该检查对来自动物细胞溶解(例如质粒，ATP)的背景干扰敏感性较低。

6.1.5呼吸作用

这一大类包括经典呼吸计，气体顶空分析以及自动血液培养系统。利用仪器设备、<71>无菌检查法中规定的20～25℃和30～35℃的培养温度、以及独特的好氧和厌氧液体培养基配方，可通过5 d内的培养，恢复大部分引起血流感染的微生物。此项技术已经成功扩展到细胞治疗产品的无菌检查上来，使用7天培养的方法替代药典无菌检查法进行批量放行。

其他仪器也可用于检测和计算呼吸的微生物。例如，可调谐二极管激光吸收光谱(TDLAS)可以检测在含有生长微生物培养基的密闭单元中氧气的消耗或二氧化碳的增加。该技术最初是为检测密闭单元中气体顶空成分而开发的，也可以用于介质自动填充检测。该系统有气体校准标准，如果要用于无菌检查(例如，校准大体积容器)，则需要进行微小调整。[注意—呼吸平台所有系统都需要检测微生物生长和代谢活动，通常需要2～7天才能得到结果。但如果在培养早期对结果进行逐步监测以发现无菌试验的失败，这对上述风险评估中短效期产品来讲是一个巨大的优势。]

6.1.6固相细胞计数

基于固相细胞计数的仪器系统，结合荧光标记技术和固相激光扫描技术，可以快速地对可过滤液体中的微生物进行计数。在0.45μm的聚酯膜上过滤收集微生物，然后用背景和活性染料进行处理。过滤器在细胞仪中被高速的488nM氩气激光扫描。多个光电倍增管，根据其大小、形状和荧光强度，检测荧光对标记微生物和背景噪声进行区分。扫描呈现出一幅识别荧光事件位置的地图，其是通过带有自动机械化平台的荧光显微镜来定位单个事件的。据称该系统可以在2～3 h内检测到单个活菌。应该指出的是，大多数细胞治疗产品是不可过滤的，所以这项技术可能与这些类型的产品不兼容。

7、适用性检查

基于生长的无菌试验方法适用性要求，见<71>无菌检查法。试验的适用性必须证明对每个待测产品都适用。在存在残留样品的情况下，以直接接种法或膜过滤法处理后，微生物生长培养基中清晰可见其生长，则证明少于100 cfu水平的美国药典规定的挑战微生物可以回收。利用来自实验室培养菌落以外的信号时(例如核酸、三磷酸腺苷和活细胞的荧光标记)，实际样品的检测结果可能会与使用其它技术得出的结果不相同。然而，方法适用性试验要确认所分析的样品不会抑制快速检查方法中与信号生成相关的酶促反应。

8、术语

菌落生成单位(cfu):活体微生物在固体微生物培养基上，形成独立、可见菌落的生长能力。

检测限(LOD):代表1个活体微生物的最低信号，可以被常规检测到。

患者安全:快速微生物检查在产品实施前完成，可以将使用受污染产品患者的发病率和死亡率降低。

正电子发射层析显像(PET):一种核医学功能显像技术，用于观察体内的代谢过程以帮助诊断疾病。该系统检测一对间接发出的伽玛射线，其由引入体内的正电子发射的放射性核素(示踪剂)产生。

依据风险评估的快速微生物检查法:利益相关者在考虑检测限、样本量、特异性和结果时间后选择的一种快速微生物检查方法，通过在短效期产品使用前完成检查，从而提高患者安全。

特异性:检测多种不同细菌、酵母菌和霉菌的能力。

结果时间:完成微生物检查和获得样品检查不存在污染结论的时间。

参考文献:

[1]刘洪祥,张文燕,曹晓云.《美国药典》(35/NF30)附录微生物特征描述､鉴定和菌株分型[J].中国药品标准,2013,14(6):440

[2]张伟.《中国药典》2020年版编制工作最新进展[J].中国食品药品监管,2019(11):14

[3]刘洪祥,杨倩,解慧,等.《欧洲药典》(9. 2)2. 6. 27.细胞制品的微生物检查[J].中国药品标准,2019,20(2):115

[4]曹萌,李建平. CAR-T细胞技术产品欧美监管情况探讨[J].中国医药工业杂志,2018,49(10):1459

[5]荣斌,吴纯启,原野,等. CAR-T细胞治疗产品及其非临床评价研究概述[J].中南药学,2019,17(9):1381

[6]孙巍群,陈锦阳,刘军权.临床用细胞培养实验室质量控制[J].中华临床实验室管理电子杂志,2019,7(3):173

[7]虞淦军,吴艳峰,汪珂,等.国际细胞和基因治疗制品监管比较及对我国的启示[J].中国食品药品监管,2019(8):4

[8]刘昌孝,闫凤英,曹彩.发展监管科学,促进细胞治疗产品和技术应用科学规范发展[J].药物评价研究,2019,42(11):2125

[9]王刚.细胞和基因治疗产品监管政策的中美比较[J].中国食品药品监管,2019(8):20

刘洪祥,李娅男,白海娇,曹晓云.《美国药典》(42/NF37)<1071>无菌短货架期产品放行的快速微生物检查法:依据风险评估的方法[J].中国药品标准,2020,21(03):195-201.