眼科门诊较常见的疾病为干眼症[1]。干眼症是指任何原因造成的泪液质或量异常或动力学异常，导致泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适和(或)眼表组织病变特征的多种疾病的总称，又称角结膜干燥症，是一种日益严重的公共卫生问题，会导致眼部不适或视力障碍，全球发病率为5%～35%[2-3]。干眼症现有干预方法以对症干预为主，如应用人工泪液、激素类滴眼剂、干预性隐形眼镜等，干预方法存在一定不良反应[4-5]。因此，寻找一种能抑制眼表炎症的新药或用品成为眼科临床关注的重点。

中医认为，干眼症属“燥痹”“白涩症”“神水将枯症”等范畴。若气运太过，则横生燥气，耗伤津液，感而受之，肝肾亏虚、气血津液不足，无法上输于目，导致眼干燥[6]。自《山海经》开始出现眼部疾病用药记载以来，中医药干预眼科疾病已有数千年历史[7]。中医药防治干眼症具有优势，除辨证施治服用中药汤剂外，尚可辅助中药熏蒸、雾化、热敷、推拿以及针灸等疗法，且无明显不良反应[8-10]。其中，以眼贴作为载体的中药热敷疗法在眼科疾病的防治中发挥了重要作用。复方密蒙花蒸汽眼贴由枸杞子、桑叶、密蒙花、鱼腥草、马齿苋等中药组成，具有清热解毒、养肝明目之功。本研究在前期实验研究[11]的基础上复制小鼠干眼症模型，观察复方密蒙花蒸汽眼贴经湿敷和热敷双重疗法作用于干眼症模型的药效特点，以期为干眼症患者应用提供实验依据。

1、材料

1.1动物

SPF级BALB/c雄性小鼠100只，体质量19～22 g,购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，生产许可证号：SCXK(鲁)20190003;动物合格证号：370726221100163983。将小鼠饲养在温度20～24℃,湿度44%～54%,光照/黑暗周期为12 h/12 h的实验环境中，提供自由食物和饮水。动物实验经河南中医药大学实验伦理委员会批准，伦理审批号：DWLL20220419。

1.2药物与试剂

复方密蒙花蒸汽眼贴由眼贴和眼罩组成，眼贴包含枸杞子、桑叶、密蒙花、马齿苋、鱼腥草等中药，眼罩包含发热基质(郑州市新视明科技工程有限公司，批号：20220102);99% D-半乳糖(上海麦克林生化科技有限公司，批号：C13665375);药用级苯扎氯铵(Sigma Aldrich,批号：1001145757);泪液检测滤纸条、角膜荧光素钠眼科检测试纸(天津晶明新技术开发有限公司，批号：20181205、2021091101);白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)检测试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：GB11113、GB11117、AF7014)。

1.3仪器

电子天平(上海精密科学仪器有限公司，型号：FA2204B);高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司，型号：KDC-160HR);可调式移液器(上海雷勃分析仪器有限公司，型号：P32563C);裂隙灯显微镜(上海美沃仪器集团有限公司，型号：S350S)。

2、方法

2.1干眼症模型制备[12-13]

小鼠适应性饲养1周后，随机分为空白组、模型组、纱布组、蒸汽眼贴干预大、小剂量组以及蒸汽眼贴预防大、小剂量组，每组12只。小鼠双眼均滴入5μL 0.2%苯扎氯铵溶液(0.2 g苯扎氯铵粉末溶于99.8 mL双蒸水),2次·d-1,连续2周，成功复制小鼠干眼症模型。分别记录造模前、造模后、应用眼贴后泪液分泌量，评估干眼情况。

2.2分组及外敷给药

造模成功后，除空白组、模型组外，纱布组小鼠外敷湿润纱布，蒸汽眼贴预防大、小剂量组(采取边造模边给药的方式),蒸汽眼贴干预大、小剂量组(采取先造模后给药的方式)小鼠外敷蒸汽眼贴，每次30 min,每天1次，连续2周，眼贴、纱布外敷眼贴面积均为7 mm×3 mm。

2.3泪液质量检测

于造模前、造模后、外敷眼贴14 d后测定每组小鼠泪液分泌量。小鼠使用泪液分泌试纸进行泪液分泌量检测，判断是否成模。造模2周后进行角膜免疫荧光染色法(immunofluorescence, IF)评分。

2.4 HE染色观察小鼠角膜形态学

外敷眼贴14 d(禁食不禁水12 h),次日上午外敷眼贴后称取小鼠体质量，摘眼球，取角结膜组织后迅速放入40 g·L-1多聚甲醛中固定，将固定后的组织取出，进行石蜡脱水包埋切片，采用HE染液进行染色，在荧光显微镜下观察并拍照。

2.5免疫荧光染色检测角膜组织IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子表达

根据HE染色结果分析，每组挑选3只在40 g·L-1多聚甲醛中固定后的组织，进行石蜡脱水包埋切片，采用5%BSA封闭后用PBS洗涤，滴加相应的一抗及二抗。显微镜下观察，并计算各组小鼠角膜组织IL-1β、IL-6、TNF-α的表达量。

2.6统计学方法

采用SPSS 26.0统计学软件进行分析，计量资料用均数±标准差表示；多组间比较采用单因素方差分析，方差不齐时采用Games-Howell法检验；组间两两比较采用LSD法检验，等级资料采用Ridit检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1各组小鼠造模2周后角膜FL评分比较

与空白组比较，模型组FL评分显著升高(P<0.01),提示模型复制成功。与模型组比较，复方密蒙花蒸汽眼贴预防大剂量组可明显降低角膜FL评分(P<0.05),复方密蒙花蒸汽眼贴预防小剂量组和干预大、小剂量组仅有降低角膜FL评分的趋势，见表1。

表1各组小鼠造模2周后角膜FL评分比较

3.2各组小鼠不同时期泪液分泌量比较

分别在造模前、造模后及外敷眼贴第14天测每组小鼠右眼泪液分泌量，结果见表2。由表2可知，造模前各组小鼠泪液分泌量无明显差异，说明分组均匀。造模后，与空白组比较，模型组泪液分泌量显著降低(P<0.01);与模型组比较，蒸汽眼贴预防大剂量组泪液分泌量显著增加(P<0.01),眼贴预防小剂量组泪液分泌量明显增加(P<0.05)。眼贴外敷14 d后，与模型组比较，复方密蒙花蒸汽眼贴干预大、干预小剂量组泪液分泌量显著增加(P<0.01)。

表2各组小鼠不同时期泪液分泌量比较

3.3各组小鼠角膜组织形态比较

HE染色显示，空白组镜下可见角膜上皮层细胞层次清晰，细胞形态从基底层至表层均正常。模型组可见角膜上皮层细胞层次杂乱，胞索间排列紊乱，表层细胞明显减少，可见空泡、核碎裂细胞。纱布组可见角膜上皮层细胞层次杂乱，胞索间排列紊乱，表层细胞减少。复方密蒙花蒸汽眼贴干预大剂量组可见角膜上皮层细胞层次较模型组清晰，胞索间排列较模型组整齐，上皮层细胞较空白组少、较模型组多，空腔细胞少见，表层细胞较模型组增多；蒸汽眼贴干预小剂量组可见角膜上皮层细胞层次较清晰，胞索间排列不太整齐，表层细胞较模型组有所增多。复方密蒙花蒸汽眼贴预防大剂量组可见角膜上皮层细胞层次不清，上皮层细胞排列紊乱且少；蒸汽眼贴预防小剂量组可见角膜上皮层细胞层次不清，排列紊乱，上皮层细胞明显减少，可见空泡细胞。见图1。

与空白组比较，模型组角膜出现显著病理变化；与模型组比较，复方密蒙花蒸汽眼贴干预大、小剂量组可使小鼠角膜病变显著减轻，纱布组和复方密蒙花蒸汽眼贴预防大、小剂量组对小鼠角膜病变无明显改善。见表3。

3.4各组小鼠角膜组织IL-1β、IL-6、TNF-α表达量比较

与空白组比较，模型组小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α表达量显著升高(P<0.01)。与模型组比较，复方密蒙花蒸汽眼贴干预大、小剂量组IL-1β表达量显著降低(P<0.01);复方密蒙花蒸汽眼贴干预大剂量组IL-6、TNF-α表达量显著降低(P<0.01),复方密蒙花蒸汽眼贴干预小剂量组IL-6表达量明显降低(P<0.05)。见表4,图2—图4。

表3各组小鼠角膜组织形态比较

图1各组小鼠角膜组织HE染色图(×200)

表4各组小鼠角膜组织IL-1β、IL-6、TNF-α表达量比较

图2各组小鼠角膜组织IL-1β免疫荧光染色图(×200)

图3各组小鼠角膜组织IL-6免疫荧光染色图(×200)

图4各组小鼠角膜组织TNF-α免疫荧光染色图(×200)

4、讨论

干眼症是一种常见的慢性眼部疾患，以患者缺乏高质量的泪液滋润眼球为特点。近年来，干眼症的发病人群逐渐趋于年轻化[14]。研究认为，苯扎氯铵作为防腐剂的一种，能导致泪膜稳定性与泪液分泌异常，泪液检查是干眼症评价的重要指标，滴加苯扎氯铵溶液会使眼表黏蛋白发生改变，造成眼球的表面损伤[15-18]。

本研究采用苯扎氯铵溶液滴眼制备小鼠干眼症模型，诱导模型后进行泪液分泌量检测与荧光素钠染色评分后发现，小鼠诱导干眼症模型成功。采用复方密蒙花蒸汽眼贴对苯扎氯铵诱导的干眼症小鼠进行干预，可以增加泪液分泌量。这证明复方密蒙花蒸汽眼贴对于苯扎氯铵诱导的干眼症小鼠有一定的改善效果。干眼症的潜在发病机制通常被认为与眼表高渗环境引起的炎症反应有关，角膜高渗环境激活炎症信号通路导致眼表炎症，最终形成干眼症[19],过强的IL-2、TNF-α等炎症应激反应导致干眼症的发生[20]。研究表明，角膜上皮细胞保护屏障遭到破坏，细胞活性下降，进而引起角膜上皮细胞中TNF、IL-1α等促炎因子大量分泌[21]。因此，本研究选择相关炎症因子诱导的优势雄性BALB/c小鼠作为研究对象，通过IF检测小鼠角膜组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平，与空白对照组比较，模型组IL-1β、IL-6、TNF-α的表达明显升高，说明干眼症模型角膜组织中含有较高水平的炎症因子，验证了干眼症与炎症具有一定的相关性。眼表上皮细胞的病理生理变化是干眼症动物模型评价的关键指标，结膜杯状细胞密度降低、结膜上皮鳞状化生增加、核浆比N/C比例缩小等通常是眼表上皮细胞异常表现[22-23]。角膜病理形态观察发现，与空白对照组比较，模型组可见角膜上皮层细胞层次杂乱，细胞数量明显减少，形态不完整等变化，而复方密蒙花蒸汽眼贴干预组可改善角膜细胞的排列紊乱。

《审视瑶函·白痛》中对干眼症症状的描述为“不赤不肿，爽快不得，沙涩昏朦，名曰白涩”[24-25]。复方密蒙花蒸汽眼贴由枸杞子、桑叶、密蒙花、鱼腥草、马齿苋等中药组成。枸杞子、密蒙花、桑叶三药合用，能滋养肝肾、清肝明目，有效缓解因肝肾不足导致的眼睛不适；配伍鱼腥草、马齿苋具有利湿消肿、清热解毒、疏散风热之功。全方具有清热解毒、滋养肝肾、明目清肝、抗炎抗菌等多重作用，能够有效缓解干眼症的症状。复方密蒙花蒸汽眼贴以中药熏蒸的方法为基础[26-27],以眼贴为载体，将中药药液滴加在眼贴之后覆盖到无尘活性炭制作的眼罩上，采用湿敷和热敷双重形式的热效应，将眼贴贴敷于眼部持续20 min以上，维持40℃左右。加热的润目罩可促进药液对眼周皮肤的滋润作用，进而改善眼部血液循环、促进泪液分泌，滋润眼周皮肤，缓解眼睛干涩、发痒等不适症状。

综上，复方密蒙花蒸汽眼贴的滋润护眼作用可能通过调控局部炎症因子表达而实现的，但复方密蒙花蒸汽眼贴如何从更深层次的分子机制防治干眼症还需要进一步研究分析。

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基金资助:岐黄学者项目(国中医药人教函2022-6);河南省国际科技合作重点项目(231111521200);

文章来源:张秋霞,张双丽,宫欢欢,等.复方密蒙花蒸汽眼贴对干眼症模型小鼠角膜炎症的影响[J].中医学报,2024,39(12):2648-2654.