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茯苓酸调节VEGFC/VEGFR3信号通路抑制结直肠癌免疫逃逸

2024-12-13 108 上传者：管理员

摘要：目的探讨茯苓酸（PA）对结直肠癌荷瘤小鼠免疫调节的影响及其机制。方法使用不同浓度的PA处理MC38细胞，检测PA对MC38细胞增殖及培养上清液血管内皮生长因子（VEGF）C、VEGF受体（VEGFR）3水平的影响；建立结直肠癌荷瘤小鼠模型，将荷瘤小鼠脾脏分离的CD8+T细胞与PA共同处理MC38细胞，检测PA对CD8+T细胞杀伤MC38细胞及白细胞介素（IL）-2、干扰素（IFN）-γ水平的影响；建立荷瘤小鼠模型后，将小鼠随机分为模型（Model）组、PA组、转染病毒阴性对照（LV-NC）组、转染VEGFC病毒（LV-VEGFC）组，分别检测移植瘤组织淋巴管内皮细胞透明质酸受体（LYVE）-1、VEGFC、VEGFR3蛋白表达，流式细胞仪检测移植瘤叉头框蛋白（FOX）P3+CD4+T、CD8+T、CD8+程序性死亡受体（PD）-1+T细胞比例，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测移植瘤组织IL-10、转化生长因子（TGF）-β1、IL-2、IFN-γ水平。结果不同浓度（10、20、40、80、160μmol/L）的PA可明显抑制MC38细胞增殖，使用40μmol/L的PA处理MC38细胞24 h后，显著降低培养液上清中VEGFC、VEGFR3水平（P<0.05）;将荷瘤小鼠脾脏分离的CD8+T细胞与PA共同处理MC38细胞，可显著降低细胞存活率，培养液中IL-2、IFN-γ水平显著升高（P<0.05）;与Model组比较，PA组移植瘤生长缓慢，移植瘤体积与移植瘤质量、移植瘤组织LYVE-1、VEGFC、VEGFR3表达水平、CD8+PD-1+T与FOXP3+CD4+T细胞比例及IL-10、TGF-β1水平显著降低，移植瘤CD8+T细胞比例及IL-2、IFN-γ水平显著升高（P<0.05）;与LV-NC组比较，LV-VEGFC组移植瘤体积与移植瘤质量、移植瘤组织LYVE-1、VEGFC、VEGFR3表达水平、CD8+PD-1+T与FOXP3+CD4+T细胞比例及IL-10、TGF-β1水平显著升高，移植瘤CD8+T细胞比例及IL-2、IFN-γ水平显著降低（P<0.05）;PA组与LV-NC组各指标比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论 PA通过抑制VEGFC/VEGFR3信号通路，抑制免疫逃逸，抑制结直肠癌荷瘤小鼠肿瘤生长。

关键词：
免疫逃逸
发病率
结直肠癌
茯苓酸
血管内皮生长因子C/血管内皮生长因子受体3信号通路
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结直肠癌为消化系统恶性肿瘤，发病率与死亡率位居第3,目前结直肠癌的治疗方式包括手术、放疗和化疗等，但放化疗引起的副作用及耐药性，严重影响患者的生存质量，肿瘤免疫疗法为结直肠癌治疗的一个新方向[1,2]。免疫系统与结直肠癌的发生、发展密切相关，肿瘤微环境是一个复杂的细胞和分子网络，在癌症发展过程中，细胞因子、趋化因子和生长因子的释放可能会抑制免疫监测，这些都可以诱导免疫耐受，表现为免疫逃逸现象[3]。中药因为毒副作用小，具有免疫调节作用，在抗肿瘤活性中体现出独特优势[4]。茯苓酸(PA)是茯苓的活性成分之一，具有降糖、镇定催眠、抗氧化、保护神经等多种药理作用[5]。PA还具有抗肿瘤活性，如在肝癌、胃癌等消化道肿瘤中可抑制肿瘤细胞生长与迁移，诱导细胞凋亡[6,7]。PA在结直肠癌中作用尚不清楚，本研究探讨PA对结直肠癌的影响及可能的作用机制。

1、材料与方法

1.1动物来源

SPF级BALB/c小鼠(6～8周龄，体质量20～22 g)购自华中科技大学动物实验中心，动物生产可证号：SCXK(鄂)2021-0009。

1.2主要试剂

小鼠结直肠癌细胞株MC38购自中科院上海细胞库。PA(HPLC≥98%,货号：ST20180110)购自上上海诗丹德标准技术服务有限公司；增强型绿色荧光蛋白标记的血管内皮生长因子(VEGF)C腺病毒(Ad-EGFP-VEGFC)及EGFP标记的空载腺病毒(Ad-EGFP)购自上海吉凯基因化学技术有限公司；小鼠VEGFC(E-EL-M1230c)、白细胞介素(IL)-10(E-EL-M0046c)、转化生长因子(TGF)-β1(E-EL-0162c)、IL-2(E-EL-M0042c)、干扰素(IFN)-γ(E-EL-M0048c)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自Elabscience公司；小鼠VEGF受体(VEGFR)3 ELISA试剂盒(ab203367)、兔抗小鼠淋巴管内皮细胞透明质酸受体(LYVE)-1(ab218535)、VEGFC(ab9546)、VEGFR3(ab27278)抗体及荧光标记的异硫氰酸荧光素(FITC)-CD8(ab210214)、FITC-CD4(ab269349)、藻红蛋白(PE)-叉头框蛋白(FOX)P3(ab210231)、PE-程序性死亡受体(PD)-1(ab210291)、Alexa Fluor®488标记的免疫球蛋白(Ig)G二抗(ab150077)Abcam公司。

1.3细胞增殖实验

MC38细胞以每孔2×104个细胞接种于96孔板中，使用不同浓度(10、20、40、80、160μmol/L)的PA分别处理MC38细胞24、48、72 h后，CCK-8法检测细胞增殖。使用40μmol/L的PA处理MC38细胞24 h为PA组，另设Control组，不做处理，收集细胞培养液，4℃12 000 r/min离心5 min,采集上清，ELISA法检测VEGFC、VEGFR3水平。

1.4 CCK8法检测CD8+T细胞对MC38细胞杀伤效应

将对数生长期的MC38细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)制成107个/ml细胞悬液，取200μl细胞悬液皮下注射到BALB/c小鼠，建立荷瘤小鼠模型，1 w后，脱颈处死荷瘤小鼠，无菌条件下分离小鼠脾脏，制备脾脏单细胞悬液，加FITC-CD8抗体，分离CD8+T细胞，按照15∶1比例，将分离的CD8+T细胞与40μmol/L PA处理的MC38细胞接种至96孔板中，作为PA+CD8+T组，另选择40μmol/L PA处理的MC38细胞(不含CD8+T细胞)作为PA组，共培养24 h后，吸弃含有CD8+T细胞的培养基，CCK-8法检测细胞存活率。另收集上述两组的细胞液，4℃条件下12 000 r/min离心5 min,采集上清，ELISA法检测培养上清液IL-2、IFN-γ水平。

1.5建模与分组

建立荷瘤小鼠模型后，将小鼠随机分为模型(Model)组、PA组、转染病毒阴性对照(LV-NC)组、转染VEGFC病毒(LV-VEGFC)组，每组15只，PA组使用50 mg/kg PA腹腔注射[8],LV-NC组与LV-VEGFC组除腹腔注射50 mg/kg PA外，肿瘤内注射50μl空病毒Ad-EGFP或Ad-EGFP-VEGFC载体，Model组给予等量生理盐水，PA连续给药4 w,每周检测肿瘤体积，末次给药24 h后，无菌条件下分离肿瘤，测量肿瘤质量。

1.6免疫荧光检测移植瘤LYVE-1表达

随机选择5只荷瘤小鼠移植瘤组织，4%多聚甲醛固定后石蜡包埋，切成4μm切片，经脱蜡水化及封闭后，加入LYVE-1抗体(1∶1 500稀释),室温孵育60 min,再加入Alexa Fluor®488标记的IgG二抗，室温孵育1 h, 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)复染细胞核，显微镜观察LYVE-1蛋白表达，计算LYVE-1阳性表达率。

1.7 Western印迹法检测移植瘤组织VEGFC、VEGFR3蛋白表达

随机选择5只荷瘤小鼠移植瘤组织，一部分用于IL-10、TGF-β1、IL-2、IFN-γ水平检测。另一部分移植瘤组织，加入放射免疫沉淀(RIPA)裂解液，匀浆后，12 000 r/min离心10 min,取上清，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒定量，经过电泳、转膜、封闭后，加入兔抗鼠VEGFC、VEGFR3抗体(1∶1 500稀释),37℃孵育2 h, PBST洗膜后，加入IgG二抗(1∶1 000稀释),室温孵育1 h,化学发光法显色，使用ImageJ软件分析蛋白表达。

1.8流式细胞仪检测移植瘤FOXP3+CD4+T、CD8+T、CD8+PD-1+T细胞

剩余5只小鼠移植瘤，加入5～10 ml的RPMI1640基础培养基，剪碎肿瘤组织，1 500 r/min离心5 min,弃上清，加入RPMI1640基础培养基重悬细胞，再加入500μl的10倍混合酶溶液，37℃孵育2 h, 200目筛网过滤，PBS洗涤，1 600 r/min离心5 min,获取细胞沉淀，RPMI1640重悬细胞，加入FITC-CD8、PE-PD-1、FITC-CD4、PE-FOXP3抗体，流式细胞仪分析FOXP3+CD4+T、CD8+T及CD8+PD-1+T细胞比例。

1.9 IL-10、TGF-β1、IL-2、IFN-γ水平检测

取小鼠移植瘤组织，按质量体积比=1∶9加入生理盐水匀浆后，12 000 r/min离心15 min后取上清，采用ELISA法检测上清液IL-10、TGF-β1、IL-2、IFN-γ水平。

1.10统计学方法

采用SPSS25.0软件进行正态分布检验、单因素方差分析、LSD-t检验、独立样本t检验。

2、结果

2.1 PA对结肠癌细胞增殖及VEGFC、VEGFR3的影响

使用不同浓度(10、20、40、80、160μmol/L)的PA分别处理MC38细胞24、48、72 h后，可明显抑制MC38细胞增殖，经计算PA处理24 h对MC38的IC50为64.22μmol/L,见表1。与Control组比较，PA组VEGFC、VEGFR3水平显著降低(P<0.05),见表2。

表1 PA对结直肠癌细胞增殖的影响

表2 PA对结直肠癌细胞VEGFC、VEGFR3的影响

2.2 PA对CD8+T细胞杀伤MC38细胞及IL-2、IFN-γ水平的影响

与PA组比较，PA+CD8+T组细胞存活率显著下降，且培养液中IL-2、IFN-γ水平显著升高(P<0.05),见表3。

表3 PA对CD8+T细胞杀伤MC38细胞及TNF-α、IFN-γ水平的影响

2.3 PA对移植瘤生长的影响

与Model组比较，PA组移植瘤生长缓慢，移植瘤体积(14、21、28、35 d)与移植瘤质量显著降低(P<0.05);与LV-NC组比较，LV-VEGFC组移植瘤体积(14、21、28、35 d)与移植瘤质量显著升高(P<0.05);PA组与LV-NC组移植瘤体积与质量比较差异无统计学意义(P>0.05),见图1、表4。

图1 PA对移植瘤生长的影响

表4 PA对移植瘤体积及移植瘤质量的影响

2.4各组移植瘤组织VEGFC、VEGFR3表达比较

与Model组比较，PA组移植瘤组织VEGFC、VEGFR3表达水平显著降低(P<0.05),与LV-NC组比较，LV-VEGFC组移植瘤组织VEGFC、VEGFR3表达水平显著升高(P<0.05),PA组与LV-NC组VEGFC、VEGFR3表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05),见表5、图2。

2.5各组淋巴管比较

与Model组比较，PA组移植瘤组织LYVE-1阳性表达率显著降低(P<0.05);与LV-NC组比较，LV-VEGFC组移植瘤组织LYVE-1阳性表达率显著升高(P<0.05);PA组与LV-NC组LYVE-1阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05),见表5、图3。

2.6各组抑制瘤组织FOXP3+CD4+T、CD8+T及CD8+PD-1+T比较

与Model组比较，PA组移植瘤CD8+T细胞比例升高，CD8+PD-1+T与FOXP3+CD4+T细胞比例显著降低(P<0.05);与LV-NC组比较，LV-VEGFC组CD8+T细胞比例显著降低，CD8+PD-1+T与FOXP3+CD4+T细胞比例显著升高(P<0.05);PA组与LV-NC组CD8+T、CD8+PD-1+T、FOXP3+CD4+T比较差异无统计学意义(P>0.05),见表5。

表5各组移植瘤组织LYVE-1、VEGFC、VEGFR3、FOXP3+CD4+T、CD8+T及CD8+PD-1+T表达比较

图2 Western印迹检测各组移植瘤组织VEGFC、VEGFR3表达

2.7各组移植瘤组织IL-10、TGF-β1、IL-2、IFN-γ水平比较

与Model组比较，PA组移植瘤组织IL-10、TGF-β1水平显著降低，IL-2、IFN-γ水平显著升高(P<0.05);与LV-NC组比较，LV-VEGFC组移植瘤组织IL-10、TGF-β1水平显著升高，IL-2、IFN-γ水平显著降低(P<0.05);PA组与LV-NC组IL-10、TGF-β1、IL-2、IFN-γ水平比较差异无统计学意义(P>0.05),见表6。

图3免疫荧光检测各组移植瘤组织LYVE-1表达(×100)

表6各组移植瘤组织IL-10、TGF-β1、IL-2、IFN-γ水平比较

3、讨论

PA是从茯苓中提取的一种四环三萜化合物，具有利尿、安眠、抗氧化、抗衰老、抗炎和抗肿瘤等生物活性[9]。PA具有多种抗肿瘤活性，如在宫颈癌中，PA通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路，诱导内质网(ER)相关基因表达、线粒体膜电(MMP)变化、三磷酸腺苷(ATP)耗竭、活性氧(ROS)生成，诱导肿瘤细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用[8]。在舌鳞状细胞癌细胞中，PA可能通过抑制趋化因子受体(CXCR)4表达，诱导细胞周期阻滞，抑制舌鳞状细胞癌细胞增殖，诱导细胞凋亡[10]。PA还可通过缺氧上调Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达，增加胃癌细胞对放疗敏感性[11]。PA通过激活第10号染色体缺失的磷酸酶基因(PTEN)/蛋白激酶B(AKT)信号通路，诱导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)3/7活性，促进骨肉瘤细胞凋亡[12]。本研究显示，10～160μmol/L PA可显著抑制MC38细胞增殖，体内研究显示，PA可显著抑制结直肠癌荷瘤小鼠肿瘤生长，表明PA在结直肠癌中也表现出抗肿瘤活性，但其具体作用机制尚不清楚。

血管内皮生长因子(VEGF)配体有A、B、C、D、E等多种亚型，VEGFC与其受体VEGFR3是淋巴管形成和病理性淋巴管生成的主要驱动因素，有活性的VEGFC可激活VEGFC/VEGFR3信号通路，诱导肿瘤间质淋巴管内皮细胞增生、分化，促进肿瘤细胞向淋巴道趋化、侵袭和转移[13]。研究显示，在结直肠癌中，有活跃的淋巴管生成，并介导结直肠癌其转移过程[14]。LYVE-1是淋巴管内皮细胞透明质酸(HA)的主要受体，是淋巴管的常用标志物[15]。在结直肠癌中，激活VEGFC/VEGFR3信号通路，促进肿瘤免疫逃逸，导致肿瘤生长[16]。本研究结果提示，PA可抑制VEGFC、VEGFR3表达；可能通过抑制VEGFC/VEGFR3信号通路激活，抑制结直肠癌肿瘤生长。

T细胞为肿瘤微环境中发挥免疫效应的免疫细胞，包括CD8+和CD4+T细胞，CD8+T细胞又称细胞毒性T淋巴细胞(CTLs),是抗肿瘤免疫的主要作用因子[17]。PD-1是免疫外周检查点，通过与肿瘤细胞等靶细胞上的配体PD-L1结合，抑制CD8+T细胞抑制信号，CD8+T细胞杀死肿瘤细胞的作用可被PD-L1/PD-1抑制[18]。Treg细胞由CD4+T细胞分化而来，可抑制CD8+T细胞、自然杀伤细胞等细胞活化与增殖，分泌IL-10等细胞因子促进肿瘤生长，IL-10、TGF-β为免疫抑制因子，在肿瘤中参与免疫逃逸[19]。IL-2、IFN-γ是免疫调节因子，通过增加主要组织相容性一类分子(MHC-Ⅰ)和共刺激分子的表达，通过免疫调节发挥抗肿瘤作用[20]。本研究提示，PA可能通过提高结直肠癌细胞的免疫调节，抑制肿瘤细胞增殖；PA可提高肿瘤CD8+T细胞浸润，促进IL-2、IFN-γ分泌，并抑制CD8+PD-1+T、Treg细胞及IL-10、TGF-β分泌，通过抑制结直肠癌细胞免疫逃逸发挥抗肿瘤作用；PA通过抑制VEGFC/VEGFR3信号通路，抑制免疫逃逸，发挥抗肿瘤作用。

参考文献:

4冯子芳,杨瑞宾.白术多糖通过TLR4信号通路对结肠癌CT26荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫调节的影响[J].中成药,2022;44(1):231-5.

10樊燕青,孙兰池,李大鹏.茯苓酸对舌鳞状细胞癌细胞CAL-27增殖､凋亡及细胞周期的影响[J].中成药,2021;43(7):1909-14.

文章来源:董永杰,董静,贾辉,等.茯苓酸调节VEGFC/VEGFR3信号通路抑制结直肠癌免疫逃逸[J].中国老年学杂志,2024,44(23):5840-5845.