胶质母细胞瘤(GBM)具有增殖快、易侵袭、化疗耐药强等特点[1]。目前GBM的标准治疗方法是最可能的根治性切除，辅助术后放疗及替莫唑胺治疗。基底膜侵袭是导致根治性失败的主要障碍，并导致治疗后肿瘤复发[2]。因此，开发治疗GBM的新方法在临床中尤为重要。分子氢是一种医用气体，在实验动物中发现，吸入1%～4%分子氢气可显著缩小大鼠脑梗死的范围[3]。近年来，分子氢在癌症中的作用引起了人们的极大关注。有研究者发现[4],在8 atm的总压下用97.5%分子氢气高压治疗2 w,可以显著地诱导小鼠肿瘤的消退。但由于高压分子氢处理的特殊条件，对低浓度分子氢的生物学效应及其抗癌作用的研究一直停滞不前。2008年，日本学者报道称[5],中性pH富分子氢电解水(NHE水)可在体外细胞模型中实现对肿瘤生长和肿瘤侵袭的抑制。体外研究表明[6],分子氢可有效抑制癌细胞的增殖、迁移、侵袭和集落形成，并诱导癌细胞凋亡。体内研究表明[7],分子氢可以预防癌症发生，抑制癌症进展，减轻化疗或放射治疗的副作用，并增强化疗药物的抗肿瘤作用。尽管分子氢在癌症治疗领域显示出潜力，但其抗癌性能仅限于少数几种肿瘤类型，其潜在的分子机制仍有待确定。本研究探讨高浓度分子氢对GBM的可能治疗作用，采用体内和体外实验模型评估分子氢的潜在作用及其潜在机制。

1、材料与方法

1.1实验动物及细胞系

8周龄雄性Wistar大鼠(体质量170～180 g)和8周龄雌性BALB/c裸鼠(体质量20～24 g)购自河北医科大学生物医学工程中心[生产许可证号：SCXK(冀)2019-001]。动物在22～25℃、12 h光暗循环的标准饲养间进行饲养，可自由获得水和食物。适应性喂养1 w后进行实验。所有操作程序按照中华人民共和国《实验动物管理条例》进行。大鼠C6胶质瘤细胞和人U87细胞购于美国典型培养物保藏中心(ACTRLC)。细胞常规培养在添加10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM/F12培养液中，在含5%CO2的37℃培养箱中进行孵育。

1.2大鼠及小鼠模型构建

大鼠C6脑胶质瘤模型的建立：实验前禁食1 d。麻醉满意后固定于立体定向仪中，用手术剪刀在头骨中线切开头皮。然后，在脑桥后1 mm、矢状缝外侧3 mm的颅骨上开洞。在距颅面7 mm处插入30号针头，将C6胶质瘤细胞(1×106)注入10μl磷酸盐缓冲液(PBS)中，立体定向注射。注射超过10 min后，将针固定在适当的位置5 min,然后在3 min内逐渐退出，以防止溶液倒流。大鼠C6脑胶质瘤细胞移植后，将大鼠随机分为氢气治疗组(HI,n=10)和肿瘤对照组(CTRL,n=10)。小鼠U87皮下模型：BALB/c裸鼠皮下注射1×106个U87细胞。注射后，将小鼠随机分为氢气治疗组(HI,n=10)和肿瘤对照组(CTRL,n=10)。每周测量肿瘤体积：体积=宽度2×长度×0.4。

1.3分子氢吸入

将一个透明的封闭盒子(20 cm×18 cm×15 cm)连接到AMS-H-3型氢氧雾化器，该机器可定量产生67%H2和33%O2。于大鼠C6胶质瘤或小鼠U87皮下模型建立后第2天给予分子氢治疗，直至实验结束。将实验动物放置在盒子中，2次/d,吸入混合空气1 h。在吸入过程中，小鼠保持清醒，可自由活动。采用热示踪气相色谱对密闭箱内分子氢浓度进行监测。

1.4磁共振成像(MRI)

移植C6细胞的荷瘤大鼠用2%异氟烷吸入氧气麻醉，维持正常体温。在造模后第17天和第26天，使用常规的自旋回波序列获取T2加权图像，参数如下：重复时间(TR)=3 140 ms,回波时间(TE)=37 ms,带宽=130 Hz,翻转角度=180°,视野(FOV)=4 cm×4 cm,层厚=1 mm。

1.5组织学和免疫组织化学染色

胶质瘤组织石蜡包埋后切成8μm厚的切片。切片用3%过氧化氢处理10 min以灭活内源性过氧化物酶，然后与10%正常山羊血清孵育。去除封闭血清后，切片在4℃下与抗CD34抗体(1∶2 000)、抗Ki67抗体(1∶2 000;Abcam)、抗CD44抗体(1∶1 000;Biobyt)孵育过夜。使用辣过氧化物酶(HRP)耦联二抗进行检测，然后使用二氨基联苯胺(DAB)试剂盒进行比色检测。

1.6免疫荧光染色

将细胞接种于盖玻片上，用4%多聚甲醛(Sigma-Aldrich)固定10 min,用0.1%Triton X-100在PBS中通透，用1%牛血清白蛋白(BSA)阻断1 h,然后在4℃下与抗胶质纤维酸性蛋白胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体(1∶200;Abcam)和抗CD44抗体(1∶50;Biobyt)一抗孵育过夜。细胞与FICTRL标记的二抗(Abcam)孵育1 h,用Hoechst染色，在倒置显微镜获得荧光图像。

1.7流式细胞学检测

流式细胞仪检测CD44在培养细胞中的表达。将C6和U87细胞分为对照(CTLR)组和分子氢处理(HRM)组。细胞在4℃PBS中与10%的马血清孵育10 min,然后与一抗CD44(1∶200;Biobyt)在4℃孵育30 min。离心后，将收集的细胞与FICTRL耦联二抗(Abcam)孵育20 min。染色后，用流式细胞仪进行分析。

1.8细胞成球实验

通过细胞成球实验分析分子氢处理对胶质瘤干细胞(GSCs)分化能力的影响。收集细胞，洗去血清，悬浮在无血清DMEM培养液中。每孔计数500个细胞，接种到超低吸附性六孔培养板上进行球体形成实验。细胞培养在正常无血清或添加B27、20 ng/ml EG和20 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的无分子氢无血清培养液中培养。培养基每3 d更换1次。细胞孵育10 d,计数直径>50μm的球体。

1.9细胞迁移实验

采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力。将细胞以1.0×106个/孔的浓度接种于6孔板中培养24 h,用塑料吸管尖端在每个板的细胞表面划一条线。剩下的细胞用PBS清洗3次，去除漂浮细胞和碎片，然后在正常完全培养液或富分子氢培养液中孵育48 h。分别于伤后即刻和伤后24 h对创面愈合过程进行拍摄。

1.10细胞侵袭实验

细胞侵袭能力测定采用Transwe法进行。带有聚碳酸酯过滤器(8μm孔径)的顶室涂有50μl的基质胶。将1×105个细胞接种于100μl无血清培养基上，底部加入含或不含分子氢的650μl完全培养液。细胞在37℃下通过多孔膜迁移48 h,然后用棉签完全清除腔体上表面的细胞。固定后下表面细胞用0.1%结晶紫染色，在×100倍下计数每个插入物的5个随机视野。

1.11集落形成实验

每孔计数1 000个细胞，接种于6孔板中。将培养板在含分子氢或不含分子氢的正常完全培养液中孵育14 d,用4%多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫染色。在包含至少15个细胞的情况下，对集落进行计数。

1.12 Western印迹分析

收集C6和U87细胞，提取总蛋白，测定总蛋白的浓度，电泳分离蛋白，转膜，于5%脱脂牛奶中封闭1 h,分别加入Wnt、β-catenin一抗于4℃孵育过夜，洗膜后，加入辣根过氧化酶标记的兔抗IgG二抗室温孵育2 h,避光加入ECL显色剂显色，用Li-Cor Odyssey红外成像系统(3.0版软件，美国LI-COR公司)进行条带的灰度分析，以β-actin作为内参校正。

1.13统计学分析

采用SPSS20.0和GraphPad Prism5.0软件进行t检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，比较不同方法处理的胶质瘤模型大鼠的生存时间。

2、结 果

2.1分子氢处理抑制胶质瘤细胞的干性

分子氢处理后，与CTRL组比较，HRM组C6和U87细胞CD44表达均显著降低，GFAP表达明显升高(P<0.01),见表1、图1。流式细胞仪检测显示，与CTRL组相比，HRM组C6和U87细胞中CD44阳性细胞比例明显低于CTRL组(P<0.05),见图2、表2。

表1两组细胞CD44、GFAP平均荧光强度比较

图1两组C6、U87细胞CD44、GFAP表达(免疫光染色，×100)

图2流式细胞仪检测两组C6、U87细胞CD44阳性细胞比例

2.2分子氢处理抑制胶质瘤细胞的球体形成能力

分子氢处理后，与CTRL组比较，HRM组C6和U87细胞肿瘤球体数量明显减少，肿瘤球体明显变小(P<0.05)。见图3、表3。

2.3分子氢处理促进GSCs分化

C6细胞生长形成肿瘤球体，原代球体解离后4～5 d形成亚球。分子氢处理后，与CTRL组比较，HRM组C6细胞CD44表达明显降低，GFAP表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。见表4、图4。流式细胞仪检测显示，分子氢处理后，与CTRL组比较，HRM组C6细胞CD44阳性细胞比例[(15.47±2.36)%]明显低于CTRL组[(59.47±6.14)%;t=11.586,P<0.001]。见图5。

表2两组细胞CD44阳性细胞比例比较

图3两组细胞成球试验(×100)

表3两组肿瘤球体数量比较

表4两组C6细胞CD44、GFAP平均荧光强度比较

图4两组C6细胞GFAP、CD44表达(免疫荧光染色，×400)

图5流式细胞仪检测两组C6细胞CD44阳性细胞数

2.4分子氢处理抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭和集落形成能力

分子氢处理后，HRM组C6和U87细胞迁移率、细胞侵袭数和集落形成数明显低于CTRL组(P<0.05)。见表5、图6。

表5两组细胞细胞迁移率、细胞侵袭数、集落形成数比较

图6分子氢处理抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭和集落形成能力

2.5分子氢处理抑制胶质瘤细胞中Wnt/β-catenin通路蛋白的表达

分子氢处理后，HRM组C6和U87细胞中Wnt、β-catenin蛋白表达水平均明显低于CTRL组(P<0.05)。见图7、表6。

2.6分子氢吸入抑制脑胶质瘤体内生长

MRI结果显示，移植C6细胞后第17天，HI组、CTRL组肿瘤体积分别(53.52±5.84)、(50.39±6.02)mm3,差异无统计学意义(t=1.056,P=0.308)。第26天，HI组肿瘤体积[(218.98±32.10)mm3]显著小于CTRL组[(325.30±41.02)mm3;t=5.773,P<0.001]。生存曲线分析结果显示，HI组生存时间[(32.64±3.61)d]较CTRL组明显延长[(27.36±2.58)d;t=3.763,P=0.001]。见图8。

图7各组Wnt/β-catenin通路蛋白表达

表6分子氢处理抑制胶质瘤细胞中Wnt/β-catenin通路蛋白表达

2.7分子氢处理抑制胶质瘤中肿瘤干细胞标志物蛋白的表达

移植C6、U87细胞后，HRM组CD44蛋白、Nestin蛋白、Ki67蛋白及CD34蛋白表达均明显低于CTRL组(P<0.05)。见图9、表7。

图8分子氢吸入抑制脑胶质瘤体内生长

图9两组CD44、Nestin、Ki67、CD34蛋白表达(免疫组化染色，×100;方框，×400)

表7两组细胞细胞CD44、Nestin、Ki67、CD34蛋白表达比较

3、讨 论

分子氢对癌症的作用已在几种类型的肿瘤中得到研究，包括皮肤鳞状细胞癌、肺癌、卵巢癌、胸腺淋巴瘤、肝肿瘤、肾细胞癌和结肠癌[8]。然而，分子氢对GBM是否具有抗肿瘤作用尚不清楚。本研究证明，分子氢吸入能有效抑制GBM肿瘤的生长，延长GBM小鼠的生存时间。IHC检测进一步证实了这一点，分子氢处理抑制了增殖标记Ki67和血管生成标记CD34的表达。本研究结果表明，分子氢处理可以减弱胶质瘤细胞的癌细胞干性，体外细胞研究进一步证实了这一点。分子氢处理在体外可抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭和集落形成。

由于血脑屏障的阻隔，治疗药物很难到达GBM病灶，这也是导致患者预后不良的原因之一[9]。分子氢由于其小分子尺寸和非极性，很容易通过血脑屏障，这一特性使分子氢成为治疗GBM的候选药物[10]。值得注意的是，在体内研究中使用了67%的分子氢和33%的氧气。氢气和氧气浓度远远高于以往大多数研究。虽然低浓度的分子氢在多种疾病中的作用已被广泛报道，但一些研究使用了高浓度的分子氢，这也具有抗肿瘤的作用[11]。这表明，高浓度的分子氢可能在治疗癌症方面更有效，但分子氢的剂量-反应关系需要进一步研究。GSCs是一种罕见的GBM肿瘤细胞亚群，具有无限增殖、自我更新和多向分化的能力[12]。这些细胞负责胶质瘤的起始、侵袭、治疗抵抗和随后的肿瘤复发，因此被认为是GBM治疗的重要靶点[13]。本研究首次证明了分子氢处理可以诱导GSCs分化。体内和体外研究均表明，分子氢处理可减弱胶质瘤细胞的干性，表现为干性标志物(CD44和Nestin)的表达减少，胶质细胞标志物GFAP的表达增强。分子氢处理后，成球能力也受到抑制。

本研究结果表明，分子氢处理可上调GFAP的表达，下调CD44的表达。流式细胞分析显示，经分子氢处理的C6亚球中CD44阳性细胞数量减少。先前的研究表明[14],GSCs暴露在血清中可以诱导线粒体活性氧(ROS)和氧化应激反应，导致分化形态的出现和肿瘤干细胞标志物的下调。在一些实验中，ROS还可以诱导正常的干细胞分化。因此，作为一种抗氧化剂，分子氢诱导GSC分化似乎是矛盾的。以前的研究表明[15],分子氢可以选择性地清除高度细胞毒性的羟基自由基；然而，这种不能充分解释分子氢的不同作用。如Liu等[16]报道称，虽然分子氢不能减少间充质干细胞中的羟基自由基，但它确实有效地延长了骨髓的体外复制寿命，而不会失去分化潜能。据报道，分子氢还可通过诱导线粒体产生超氧化物来发挥有丝分裂效应。然而，确切的潜在机制还需要进一步研究。本研究结果表明，分子氢处理抑制了C6和U87细胞的迁移、侵袭和集落形成能力。一线细胞毒疗法，包括化疗和放射治疗，在阻止基底膜侵袭方面大多无效。因此，无论是单独使用还是与其他抗癌药物联合使用，分子氢对胶质瘤细胞迁移和侵袭的抑制作用使其成为一种潜在的治疗基底膜的候选药物。Wnt/β-catenin信号通路在物种进化中较为保守，参与动物胚胎的发育、器官形成等过程，Wnt/β-catenin途径的激活还与结直肠癌等多种癌细胞的恶性生物学行为有关[17]。本研究表明，分子氢能够抑制胶质瘤细胞中Wnt/β-catenin通路的激活。

基金资助:邢台市重点研发项目(2021ZC097);

文章来源:冯钰珉,李岩,王胜军,等.高浓度分子氢抑制胶质母细胞瘤增殖､侵袭的机制[J].中国老年学杂志,2024,44(23):5795-5802.