全球每年因肺癌导致的死亡人数达到179万例，新确诊的病例约为220万例，显示出肺癌在全球范围内的死亡率和发病率极高[1]。该疾病在组织、细胞和分子层面表现出显著的异质性，增加了治疗的复杂性和预后评估的难度[2]。由于肿瘤的发展涉及复杂的生物学过程和信号传导途径，传统治疗方法面临多重限制。然而，中药在肿瘤治疗中展现出独特优势。中药通过多方位、多靶点的作用，不仅能够促进肿瘤细胞凋亡、减少肿瘤血管生成、抑制肿瘤侵袭与转移，还能增强机体的免疫能力，从而综合性地抑制肿瘤生长。

中医学认为，正气亏虚是肿瘤发生和发展的根本原因[3]。黄芪作为一种传统的补气药材，具有升阳举陷、益卫固表和托毒生肌等多重功效，其在抗肿瘤治疗中的应用已显示出广泛的药理活性。黄芪的多种成分已被证明具有抗辐射损伤、增强细胞免疫功能的效果，同时能够降低患者放化疗治疗后的副作用[4],并且能延长患者的生命，提高其生活质量[5]。研究表明，黄芪被证明能够有效抑制肿瘤的生长和转移[6],展现出其在抗肿瘤治疗中的潜力。同时，它具有增强免疫系统整体功能的作用[7],这种调节能力能够促进肿瘤细胞的死亡或诱导其凋亡[8]。黄芪的多靶点作用和长期应用不易产生耐药的特性，使其在中医药防治恶性肿瘤转移及改善肿瘤微环境方面具有重要的临床意义。然而，目前关于黄芪治疗肺癌作用机制的研究结合网络药理学和分子对接技术的使用，尚不够深入。

本文通过数据挖掘与分析筛选出黄芪针对肺癌的作用靶蛋白与通路，并模拟计算配体受体的结合能力，研究黄芪治疗肺癌的潜在机制。从“药物-活性成分-靶点-疾病”的多角度探讨黄芪在肺癌治疗中的关键作用靶点、分子生物学过程和信号通路，为黄芪在肺癌治疗中的基础研究和潜在机制提供数据支持和参考思路。

1、资料与方法

本论文的研究内容主要集中在数据分析与计算模拟方面，不涉及任何动物实验或生物样本的使用。所有数据均来源于公开的数据库或文献，研究方法遵循相关伦理规范与学术标准，确保研究的严谨性与科学性。

1.1 获取黄芪主要活性成分及作用靶点

作为一种中药黄芪有多种成分组成，但发挥药效作用的成分并不清晰。通过TCMSP数据库检索黄芪已被识别的组分，并根据OB(Oral Bioavailabilit)≥30%、DL(Drug-Likeness)≥0.18的条件筛选出具有药物活性的成分[9]。每种药物成分都有其对应的治疗靶标，黄芪的活性成分通过选择TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology)数据中的“Related Targets”项目得到其对应靶标。然后，利用UniProt数据库将得到的数据通过去除非人源的蛋白和重复蛋白进一步筛选，并将靶蛋白的名称对应到统一的Gene Symbol。

1.2 获取肺癌相关基因

利用GeneCards数据库[10]检索关键词“Lung Neoplasms”,随后利用Venny 2.1在线平台获取黄芪抑制肺癌的相关基因。

1.3 绘制“药物-成分-靶点-疾病”网络

活性成分和靶蛋白之间的作用关系通过Cytoscape 3.10.2软件进行展示，将得到的数据按照节点、关系、分子名称的分类导入软件。将活性成分与靶点区分展示，以网络图的形式展示二者的关系。

1.4 构建PPI网络

使用STRING网站和Cytoscape 3.10.2软件绘制PPI(Protein-Protein Interaction)关系网络。得到的交集基因并不是都具有相关性或者是有效的治疗靶点，因此通过STRING网站进行初步筛选，去除不可靠靶点，将得到的数据以TSV格式导出。然后将得到的数据通过Cytoscape 3.10.2软件的CytoNCA插件进行二次筛选，得到核心的基因并绘制其作用关系网络。

1.5 GO和KEGG数据分析

在R 4.4.1软件中，调用“org.Hs.eg.db”包，将核心基因转换为Entrez ID。接着，使用“clusterProfiler”包，以P<0.05和Q<0.05作为显著性筛选条件进行核心基因的GO(Gene Ontology)与KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据分析，从细胞的成分功能与胞内生物通路层面解析各基因的功能。

1.6 分子对接实验

通过对配体与受体进行对接模拟，计算其结合能，根据结合能评判二者是否具有调节活性。首先，从PubChem和PDB(Protein Data Bank)数据库查找所需的配体受体的2D和3D结构文件。接下来，利用Schrödinger Maestro 12.8软件模拟对接，根据结合能进行对接筛选。最后，将对接的输出文件导入到PyMOL 3.0.4软件展示对接3D结构。

2、结果

2.1 筛选黄芪的主要成分与其作用靶点

通过TCMSP平台，筛选出87个黄芪成分，其中有16个活性成分，见表1。经过UniProt数据库的检索和筛选，最终获得了184个靶基因。

表1黄芪主要活性成分

2.2 黄芪、肺癌交集靶基因韦恩图构建

通过GeneCards数据库，共获得18 189个与肺癌相关的基因。随后，将这些基因与184个黄芪活性成分对应的靶基因进行映射，最终得到182个交集靶基因，见图1。

图1黄芪治疗肺癌靶点韦恩图

2.3 黄芪活性成分-肺癌靶点网络构建及分析

利用Cytoscape 3.10.2软件，将筛选出的与肺癌相关的基因与黄芪活性成分以网络图的形式展现其相互作用关系，见图2。网络中共有198个节点代表着成分和靶点，以及代表二者相关联的394条边。图中每种活性成分连接着多个靶蛋白，同样一个靶蛋白与多个成分相关联，显示黄芪作为中药可以通过多种成分抑制多个靶点的优势。

2.4 PPI网络构建

利用Cytoscape 3.10.2插件CytoNCA计算182个交集蛋白的中心性，并筛选出核心蛋白以绘制PPI网络，见图3。该图包含11个核心蛋白节点，其中肿瘤蛋白53(tumor protein p53,TP53)的综合得分最高，其在网络中的连接度为24。其次，雌激素受体α(estrogen receptor 1,ESR1)的连接度为17,蛋白激酶B(AKT serine/threonine kinase 1,AKT1)、 白细胞介素(interleukin 6,IL6)和肿瘤坏死因子 (mitogen-activated protein kinase 1,TNF)的连接度均为15。接下来，丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)的连接度为14,热休克蛋白90α(heat shock protein 90 alpha family class A member 1,HSP90AA1)和白血病病毒基因(FOS proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit, FOS)的连接度为13,细胞周期蛋白D1(Cyclin D1,CCND1)和核因子κB亚基(RelA proto-oncogene, NF-κB subunit, RELA)的连接度为12,而B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma 2,BCL2)的连接度为11。

图2黄芪抗肺癌靶点网络图

图3核心靶点网络图

连线代表靶点之间的关系，连线越多靶点之间关系越密切。

2.5 GO和KEGG富集分析结果

每一个基因在细胞组分和生物通路中具有不同的功能，通过GO和KEGG分析，将药物与疾病交集之后获得的182个基 因进行功能与涉及的通路分类。对于GO分析结果筛选排名前10的条目进行条形图绘制展示，对于KEGG分析结果筛选前20名进行气泡图绘制展示，见图4和图5。

GO分析结果表明，黄芪可能通过多种生物过程、细胞组分和分子功能发挥抗肺癌作用。具体而言，涉及的生物过程主要是细胞在应对外界刺激时的复杂反应。在细胞组分方面，大多数基因与膜筏、膜微区、质膜外侧和RNA聚合酶II转录调节复合体等相关。 在分子功能方面，大多数基因的功能是与转录因子 结合。KEGG分析结果显示，脂质代谢、 动脉粥样硬化、PI3K-Akt、TNF、IL-17等，都有可能是黄芪作用于肺癌的生物通 路。

2.6 分子对接

将筛选的核心靶点与对应的黄芪活性成分进行分子对接，一般认为，当最低结合能<0 kCal/mol表示配体与受体可以在自然状态下对接；<-5.0 kCal/mol表示有良好的结合活性；<-7.0 kCal/mol则有强烈的结合活性[11]。以结合能<-5 kCal/mol作为筛选标准，小于此值表明配体具有潜在的调节受体活性。结果显示，多个靶点与活性成分的结合能达到了标准，具体见表2。结合能排名前四的靶点及其对应的活性成分为：CCND1与槲皮素结合能为-9.20 kCal/mol, HSP90AA1与(6aR,11aR)-9,10-二甲氧基-6a, 11a-二氢-6H-苯并呋喃[3,2-c]色烯-3-醇结合能为-8.41 kCal/mol, ESR1与3,9-di-O-甲基尼索林结合能为-7.98 kCal/mol, 以及MAPK1与槲皮素结合能为-7.56 kCal/mol。其中，HSP90AA1与多种活性成分的结合能均<-5 kCal/mol, 这表明HSP90AA1可能是黄芪治疗肺癌的关键靶点之一。

以结合能<-7 kCal/mol为分界点，将配体与受体模拟的对接结构使用PyMOL 3.0.4进行展示。模拟显示，CCND1与槲皮素、MAPK1与槲皮素、HSP90AA1与异鼠李素及毛蕊异黄酮均能形成两个以上的氢键，具体见图6。这些结果初步验证了网络药理学预测的可靠性，进一步支持了黄芪在肺癌治疗中的潜在作用机制。

图4 GO富集分析图

纵坐标的数值表示被富集到该条目下的基因数量，横坐标代表具体的分类。

图5 KEGG富集分析图

由绿色到红色代表着Q值越来越显著，每个气泡的直径表示每个通路中包含的基因数量。

3、讨论

“肺积”、“胸痛”、“咯血”等特征，在中医学中被认为是肺癌的病症。其病因特点主要是身体的正气不足，导致痰和瘀血的积聚，主要影响肺部，属于本质虚弱、表面有实症的疾病。黄芪是一种传统的补气药材，主要归属于脾经和肺经。它具有多种功效，包括提升阳气、增强免疫力、固护表层以及促进伤口愈合等，这些特性在预防和治疗肿瘤方面非常重要。有研究表明，黄芪中的多种活性成分，具有抗肿瘤的作用。具体而言，黄芪注射液对肺癌A549细胞的增殖、侵袭和迁移具有浓度依赖性的抑制效果，随着浓度的提高其抑制效果愈加明显[12]。此外，黄芪多糖能够促进M1型巨噬细胞分泌相关因子，从而增强其对非小细胞肺癌的杀伤和吞噬能力[13]。黄芪甲苷通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，增强顺铂诱导的肺癌细胞凋亡[14]。黄芪总黄酮、芒柄花素和毛蕊异黄酮等成分也表现出抑制肺癌的作用[15],例如毛蕊异黄酮能够通过RAS/RAF/MEK/ERK信号通路抑制肺癌细胞的增殖和迁移[16]。

表2分子对接结合能

图6配体与受体模拟对接展示

通过前期数据分析，发现黄芪的核心靶点依次是TP53、ESR1、AKT1、IL6、TNF、MAPK1、HSP90AA1、FOS、CCND1、RELA和BCL2。分子对接结果显示，CCND1、MAPK1、BCL2、IL6、RELA、ESR1和HSP90AA1与黄芪的对应活性成分具有潜在的调节作用。其中，CCND1与槲皮素的结合能力最强。CCND1是Cyclin家族的一员，主要功能是调控细胞周期。在结肠癌细胞中，黄芪甲苷处理后能够显著降低CCND1的表达[17]。MAPK1是一种蛋白激酶，在肺癌、胃癌和宫颈癌等多种癌症中高表达[18]。研究表明，黄芪甲苷通过下调MAPK1的磷酸化来抑制MAPK/ERK通路的激活，从而减弱神经炎症[19]。细胞凋亡主要通过内部和外部两种途径进行[20],这两种途径都受BCL2家族的调控[21]。黄芪注射液[22]和黄芪甲苷[23]均可通过调控BCL2与Bax的表达，有效地抑制细胞凋亡。IL6是一种细胞炎症因子，研 究表明黄芪提取物能下调炎 症因子IL-6、IL-1β及TNF-α的表达[24]。RELA是一个原癌基因，编码NF-κB的p65亚基。黄芪能够下调p65的表达，减轻小鼠急性肾损伤向慢性肾脏病的转化[25]。ESR1是一种转录因子，可以被雌激素和其他生长因子激活，在宫颈癌细胞中黄芪注射液可以促进ESR1的表达[26]。此外，黄 芪的多种活性成分 与HSP90AA1有效对接。HSP90AA1是HSP90家族的一员，能够与多种伴侣相互作用，调节底物识别、ATP酶周期和伴侣功能[27-28]。研究表明，在肺癌患者的血清和癌组织中均可检测到HSP90α的表达上调，其大量表达与肺癌发展、扩散、转归关系密切[29-30]。因此，黄芪的活性成分可能通过调节CCND1、MAPK1、BCL2、IL6、RELA、ESR1、HSP90AA1靶点，对肺癌的发生发展产生影响。

KEGG富集结果显示，与黄芪抑制肺癌相关的通路主要有脂质代谢、动脉粥样硬化、PI3K-Akt、TNF、IL-17等。其中，PI3K/Akt是肺癌发生与发展的关键途径之一[31],对肿瘤细胞的凋亡、侵袭、转移和生存产生重要影响[32]。而且，活化后的Akt通过各种方式导致肿瘤细胞耐药[33]。有研究表明，黄芪注射液能够通过PI3K/Akt通路促进肺癌细胞的凋亡并影响细胞周期[34]。TNF在识别并杀伤肿瘤细胞以及参与全身炎症反应中起重要作用。肺癌的发生、发展和治疗与TNF-α水平密切相关[35]。晚期肺癌患者通常表现出明显的疼痛症状，这些症状的严重程度与血清中TNF-α水平呈正相关。而 且TNF-α通过调控NF-κB/PXR炎症途径来影响肺癌细胞的增殖、凋亡和侵袭[36]。IL-17由 IL-17A-F组成，其主要作用是诱导和介导炎症反应。研究发现，IL-17A在非小细胞肺癌中高表达，且肿瘤分期越晚，IL-17A的表达水平越高[37]。此外，IL-17A还能够促进肿瘤血管生成以及细胞的增殖、侵袭和转移[38-40]。

综上所述，本研究通过网络药理学和分子对接的方法深入探讨了黄芪在肺癌治疗中的潜在作用机制。研究发现，黄芪的有效成分通过多靶点、多途径的方式在肺癌的发生、发展中发挥重要的作用。未来的研究应进一步验证黄芪在临床应用中的有效性，并探索其与现代治疗手段的联合应用，为肺癌患者提供更为有效的治疗方案。

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基金资助:陕西省科技厅重点产业链项目(编号:2024SF-ZDCYL-02-15);陕西省中医药管理局中青年科技骨干人才项目(编号:2023-ZQNY-016);

文章来源:陈韦,崔祎,邹明君,等.基于网络药理学与分子对接分析黄芪治疗肺癌的作用机制[J].现代肿瘤医学,2024,32(24):4654-4662.