原发性肝癌是发生于肝细胞或肝内胆管细胞的恶性肿瘤，其发生率在各类癌症中排第6位，死亡率排第3位[1]。对原发性肝癌的治疗主要分为手术治疗、局部治疗和系统治疗，但这些方法在临床上的应用均有一定的局限性。中药方剂通过多成分、多途径、多靶点、多环节整合调节人体内部机制，调动机体内源性保护机制，促进人体系统自我平衡、自我修复，疗效虽相对缓慢但稳固。在恶性肿瘤的辅助治疗中，中药能够发挥其独特的优势。慈丹胶囊主要由莪术、山慈菇、马钱子粉等组成，具有化瘀解毒、消肿散结、益气养血的功效，临床上广泛应用于肺癌、原发性肝癌及消化道肿瘤的辅助治疗，能降低治疗期间不良反应的发生率并提高用药安全[2-6]。目前，对于慈丹胶囊治疗原发性肝癌的研究大多局限于临床观察和个体水平的试验，虽然其功效在临床实践中得到了10多年的验证，但仍缺乏在分子水平上科学合理的机理解释。

网络药理学可根据靶标分子、生物功能、生物活性化合物等，生成复杂的相互作用网络应用于中药方的药理研究，在生物活性化合物的发现、机理研究、质量控制等多个领域提供新的视野。网络药理学“多成分、多通路、多靶点”的特点与中医药方通过“多靶点、多效应、多途径”的治疗疾病特点相一致[7]。本研究利用网络药理学对慈丹胶囊的作用机制进行预测，将现代医药技术与中国传统医药相结合，为中医药研究提供理论依据。

1、材料与方法

1.1实验细胞、主要试剂与仪器

人肝癌细胞株HepG2细胞由汕头大学医学院药理教研室牛永东老师惠赠。慈丹胶囊（北京勃然制药有限公司），DMEM高糖培养基干粉（美国Gibico公司），胎牛血清（苏州依科赛生物科技股份有限公司），芹菜素、CCK-8试剂盒（美国MedChemExpress公司），Trizol（湖南艾科瑞生物工程有限公司），逆转录试剂盒（上海百赛生物技术股份有限公司），PCR试剂盒[宝日医生物技术（北京）有限公司]，引物委托深圳华大基因股份有限公司合成。倒置荧光显微镜（日本Nikon公司），CO2培养箱（日本SANYO公司），Spectra Max M2多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司），QuantStudio 5实时PCR仪（美国赛默飞世尔科技公司）。

1.2网络药理学分析

1.2.1慈丹胶囊有效成分及原发性肝癌靶点的获取

运用HERB (http://herb.ac.cn/）数据库查询慈丹胶囊的所有成分，将药物成分的SMILE号输入至Swiss ADME数据库（http://www.swissadme.ch/），根据“GI absorption=high”及“Druglikeness≥2yes”进行有效成分筛选，得到复方生物活性化合物。通过HERB、Pub Chem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、ZINC (https://zinc.docking.org）等数据库检索得到活性化合物的SMILES号及3D结构。在Swiss Target Prediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）输入SMILES号，预测化合物作用靶点。利用OMIM (https://omim.org/）、GeneCards (https://www.genecards.org/）、Clinical Genomic Database (https://research.nhgri.nih.gov/CGD/）等数据库进行原发性肝癌相关靶点的筛选。

1.2.2慈丹胶囊对原发性肝癌具有治疗作用靶点基因的获得

利用Venny 2.1网站（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），对慈丹胶囊有效成分作用靶点和原发性肝癌靶点取交集，获得有效成分和疾病的交集靶点。通过Cytoscape 3.8.2软件构建“中药-有效成分-靶点”调控网络。

1.2.3蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建

将通过药物-疾病Venn图得到的交集基因导入String数据库（https://cn.string-db.org），绘制慈丹胶囊治疗作用靶点蛋白交互作用网络图。将结果导入Cytoscape 3.8.2软件进行蛋白评分，以Degree平均值为标准筛选，若评分高于平均值，则该基因可能为慈丹胶囊治疗原发性肝癌的关键靶点基因。

1.2.4富集分析和分子对接

使用R语言和Cytoscape 3.8.2软件，对慈丹胶囊潜在治疗原发性肝癌的靶点基因（即交集基因）进行基因本体（gene ontology,GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析。利用AutoDock Vina 1.1.2软件进行分子对接。

1.3细胞实验

1.3.1 CCK-8细胞增殖实验

取对数生长期的HepG2细胞，按8×103个/孔接种于96孔板中。24 h后，吸弃96孔板中的完全培养基，每孔加入100μL不同浓度的含药培养基，放入37℃、5%CO2恒温培养箱中培养24 h。每孔加入100μL无血清培养基溶液（含10%CCK-8）。放入恒温培养箱中孵育1 h后，采用酶标仪测定450 nm处的吸光度值。

1.3.2细胞划痕实验

取对数生长期的HepG2细胞，按2.5×106个/孔接种于6孔板中。24 h后，用10μL枪头垂直于横线划痕。每孔加入不同浓度的含药培养基2 mL（使用无血清培养基配制），在显微镜下拍照记录0、24、48 h划痕宽度。使用Image J软件进行图片处理，并进行数据处理。

1.3.3 RT-qPCR

采用Trizol试剂从细胞中提取总RNA，用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，用PCR试剂盒进行RT-qPCR。以hCyclophilin为内参，采用2-ΔΔCT法分析目的基因的相对表达水平。引物序列如下。CTNNB1上游引物：CATCTACACAGTTTGATGCT GCT；下游引物：GCAGTTTTGTCAGTTCAGGGA。hCyclophilin上游引物：TGGTGTTTGGCAAAGTGA AA；下游引物：TCGAGTTGTCCACAGTCAGC。

1.4统计学分析

数据分析及绘图使用GraphPad Prism10和ImageJ软件。正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey检验法。所有假设检验均为双侧检验，检验水准α=0.05。

2、结果

2.1慈丹胶囊作用靶点和原发性肝癌靶点获取

通过HERB数据库查询慈丹胶囊的化学成分，经过筛选之后，其所含化学成分数量如下：莪术52个、蜂房12个、山慈菇22个、黄芪72个、僵蚕3个、人工牛黄2个、冰片33个、马钱子粉2个、鸦胆子33个、当归175个、丹参204个，与此对应的作用靶点569个。通过系统疾病靶点数据库（OMIM、GeneCards等），获得原发性肝癌靶点1 314个。

2.2慈丹胶囊-有效成分-靶点调控网络的构建

慈丹胶囊靶点和原发性肝癌靶点，取交集后得到慈丹胶囊-原发性肝癌靶点共32个。通过Cytoscape 3.8.2软件构建“中药-有效成分-靶点”调控网络，找到4个核心成分，分别为芹菜素、山豆根碱、槲皮素和山奈酚。

2.3蛋白质-蛋白质相互作用网络构建及关键靶点的获得

将32个共同靶点导入STRING数据库中，构建慈丹胶囊治疗原发性肝癌潜在靶点的蛋白质-蛋白质相互作用网络（图1A）。将蛋白质相互作用网络导入Cytoscape 3.8.2软件进行蛋白评分，CTNNB1蛋白的评分最高，可能为慈丹胶囊治疗原发性肝癌的关键靶点（图1B）。

2.4 GO和KEGG分析

对慈丹胶囊和原发性肝癌的32个共同靶点进行GO功能富集分析，发现其中关于生物过程的条目66个，主要涉及激酶活性的正向调节、多细胞生物发育、负向调控细胞增殖等；关于细胞组成的条目12个，主要涉及受体复合物、质膜、片状伪足等；关于分子功能的条目16个，主要涉及跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、三磷酸腺苷结合、蛋白酪氨酸激酶活性等（图2）。KEGG富集分析得到54条信号通路，主要涉及非小细胞肺癌、库欣综合征、肝细胞癌、酒精性肝病、钙信号通路、癌症的中枢碳代谢、细胞衰老、丙型肝炎等（图3）。

2.5分子对接

将筛选得到的活性成分和靶点进行分子对接，结果显示，慈丹胶囊的4种活性成分（芹菜素、山奈酚、槲皮素、山豆根碱）与CTNNB1蛋白的结合能分别为-1.537、-1.042、-0.691、1.977 kcal/mol。其中芹菜素与CTNNB1蛋白的结合能最小，表明芹菜素与CTBBN1蛋白的结合效果较好。因此，可以推断在慈丹胶囊中，芹菜素可能对CTNNB1蛋白的调节作用最为显著，从而在治疗过程中发挥关键作用。

图1蛋白质-蛋白质相互作用网络

A:32个共同靶点导入STRING数据库获得的慈丹胶囊治疗原发性肝癌潜在靶点的蛋白质-蛋白质相互作用网络；B：利用Cytoscape软件进行蛋白评分，图形越大，颜色越深，连接越多，评分越高。

图2慈丹胶囊治疗原发性肝癌靶点的GO分析

2.6芹菜素对HepG2细胞状态的影响

各组给药前，HepG2细胞圆润饱满、边缘清晰；对照组24、48 h后，细胞增殖变得密集，但仍保持圆润饱满、边缘清晰；芹菜素给药24 h后，细胞增殖相对对照组减慢、出现空泡；给药48 h后，80μmol/L组出现大量细胞碎片，细胞边缘不清，40μmol/L组也有少量细胞碎片（图4）。

2.7芹菜素对HepG2细胞增殖的影响

芹菜素处理24 h后，10、20、40、80μmol/L组细胞增殖均有不同程度抑制，且抑制率随浓度增加而增高，与对照组相比差异均具有统计学意义（均P<0.05），见图5。

2.8芹菜素对HepG2细胞迁移的影响

不同时间点的细胞划痕愈合情况见图6A。芹菜素处理24 h后，相对于对照组，80μmol/L组细胞迁移能力被抑制且差异具有统计学意义（P<0.05），见图6B；芹菜素处理48 h后，相对于对照组，40、80μmol/L组细胞迁移能力均受到抑制且差异均具有统计学意义（均P<0.05），见图6C。

2.9芹菜素对HepG2细胞CTNNB1基因表达的影响

芹菜素处理24 h后，相对于对照组，40、80μmol/L组细胞CTNNB1基因的mRNA表达水平被抑制（均P<0.05），见图7。

3、讨论

本研究经网络药理学筛选得到慈丹胶囊中抗原发性肝癌的主要活性成分为芹菜素、山豆根碱、槲皮素、山奈酚。这4个成分均有研究证明对肿瘤具有一定防治作用。芹菜素是一种广泛存在于水果和蔬菜中的黄酮类化合物，主要以糖基化的形式存在于蔬菜、水果和草药中[8]。研究表明，芹菜素对乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等具有良好的抗肿瘤作用，也能抑制化学性肝损伤，对肝脏有一定的保护作用[9]，并且能抗肿瘤转移[10]。芹菜素具有调节DNA甲基化、影响组蛋白修饰以及调控表观遗传相关的miRNAs表达等作用[11]。然而，研究表明，较高剂量的芹菜素可能存在诱发肝损伤的潜在风险[12]。

图3慈丹胶囊治疗原发性肝癌靶点的KEGG富集分析

图4芹菜素对HepG2细胞状态的影响

图5芹菜素处理24 h后细胞存活率

各组数据以表示，n=10;1）与对照组（0μmol/L）相比，P<0.01;2）与对照组（0μmol/L）相比，P<0.001。

图6芹菜素对HepG2细胞迁移的影响

图7芹菜素处理24h后HepG2细胞CTNNB1表达情况

各组数据以表示，n=6;1）与对照组（0μmol/L）相比，P<0.01;2）与对照组（0μmol/L）相比，P<0.001。

本研究预测得到的关键靶点CTNNB1基因，其编码的β-catenin蛋白是Wnt/β-catenin信号通路的关键下游组分。Wnt/β-catenin信号通路的异常活化与多种严重疾病的发生有关，包括结直肠癌、肝癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤，以及动脉粥样硬化、肝纤维化、慢性阻塞性肺病等非肿瘤性疾病[13]。有研究发现28%(34/123）的肝癌患者发生了CTNNB1基因突变[14]。CTNNB1基因突变主要分为功能获得突变与错义突变，功能获得突变使得Wnt/β-catenin通路的靶基因显著上调，错译突变使得β-catenin蛋白更加稳定[15]。Wnt/β-catenin通路的靶基因包括MYC、CCND1等，MYC致癌基因的产物是人类癌症中最常见的激活产物之一[16],CCND1基因编码的蛋白质是细胞周期中的关键调节因子，特别是在G1/S转换阶段。由此可见，CTNNB1的表达能力增强，β-catenin蛋白数量增加或稳定性增加，可能是导致肝癌发生的重要原因之一，抑制CTNNB1有可能发挥抗肝癌的作用。本研究结果显示芹菜素与CTNNB1蛋白的结合能最小，提示两者可能存在相互作用。细胞实验结果也进一步证实芹菜素可以抑制CTNNB1的表达。表明慈丹胶囊抗原发性肝癌的作用机制可能与芹菜素抑制CTNNB1的表达具有密切关系。由于本研究只是一个初探，还有很多不完善之处，许多问题有待进一步的研究与探讨。

慈丹胶囊在原发性肝癌治疗中的作用已经得到了临床研究的广泛支持，但对其作用机制的深入理解仍然不足。本研究采用网络药理学方法，分析了慈丹胶囊治疗原发性肝癌的潜在活性成分、作用靶点及相关信号通路，并在细胞水平进行了初步的实验验证。这些研究结果为揭示慈丹胶囊在分子层面的作用机制提供了新的视角，并为未来深入研究慈丹胶囊治疗原发性肝癌的机制打下了坚实的基础。

参考文献:

[2]董文杰.慈丹胶囊治疗原发性肝癌150例临床观察[J].内蒙古中医药, 2014, 33(3):1-2.

[3]刘光甫,黎飞,毕雪洁,等.慈丹胶囊联合TACE治疗原发性肝癌临床效果的系统评价[J].中国医院药学杂志, 2016, 36(17):1496-1500.

[4]秦星.用慈丹胶囊辅助治疗胆囊癌的临床效果观察[J].当代医药论丛, 2018, 16(3):112-113.

[5]王启明,陆辉,许家玲.慈丹胶囊联合立体定向放疗同步GP方案化疗治疗局部晚期非小细胞肺癌研究[J].临床军医杂志, 2018, 46(11):1349-1351.

[6]郑伟鸿,郑东英,郑伟达.手术联合慈丹胶囊治疗结肠癌疗效观察[J].光明中医, 2011, 26(1):103.

基金资助:广东省中医药局科研项目(20231197);广东省科技创新战略专项(大专项+任务清单)项目(STKJ2023050);广东省药学会临床用药研究基金(2023JZ17);

文章来源:辜竹萌,陈怡妹,林贵祥,等.基于网络药理学探讨慈丹胶囊治疗原发性肝癌的主要药效成分及靶点[J].汕头大学医学院学报,2024,37(04):193-199.