随着人口老龄化的进展，骨质疏松症已成为全球性公共健康问题，骨质疏松正成为吞噬老年人健康的“隐形流行病”[1,2]。目前针对骨质疏松症的治疗手段主要有药物治疗[3]，而中医药治疗骨质疏松症已有上千年的历史[4]，最早可追溯至《黄帝内经》，提出了“骨痿”“骨痹”“骨枯”等论述，辨证多为肝肾亏虚。但瘀血作为其常见的病理基础、病理产物，亦是不可忽略的因素，故补肾祛瘀法也是骨质疏松症的主要治法之一[5,6]。

丹参是唇形科植物丹参的干燥根及根茎，味苦性微寒，归心、肝经，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦的作用，是临床中常用的活血化瘀类中药[7]。现代研究发现，丹参分离出来的有效成分主要包括水溶性成分、脂溶性成分、以及黄酮类、三萜类、丹参甾醇类等其他成分，具有抗氧化、改善微循环、防止血栓等作用[8]。莫朝伦等[9]通过丹参酮Ⅱ-A诱导大鼠成骨细胞体外增殖分化，发现一定浓度的丹参酮Ⅱ-A在适宜的作用时间内，对体外培养的成骨细胞有较明显的促增殖分化作用，说明丹参酮Ⅱ-A可能通过促进成骨细胞增殖分化和成熟来促进骨改建。

桑龙等[10]发现丹参素能有效改善骨质疏松大鼠骨密度，调节破骨细胞分化因子骨保护素和核因子κB受体活化因子配体水平，从而起到抑制骨吸收的作用。由此可见，丹参具有一定的抗骨质疏松症药理基础。但是由于中药成分的复杂性，传统的单体研究策略难以充分解释丹参治疗骨质疏松症的相关作用机制，因此有必要在整体水平上研究药物、疾病、基因和蛋白相互作用的生物学过程。此次研究采用网络药理学方法系统地研究了丹参治疗骨质疏松症的主要活性成分和潜在的抗骨质疏松症作用机制[11]，以期为深入挖掘丹参抗骨质疏松症的药效物质基础和开发新的药物、改善常规抗骨质疏松症药物的治疗提供策略。

1、资料和方法

1.1 设计

构建中药活性成分-作用靶点-疾病网络。

1.2 时间及地点

实验于2019年11至12月在广州中医药大学完成。

1.3 丹参中有效成分及靶标蛋白的收集和筛选

通过检索中药系统药理学分析平台(TraditionalChineseMedicineSystemsPharmacologyDatabaseandAnalysisPlatform,TCMSP)，对丹参的全部有效成分进行收集。

1.3.1 丹参的活性成分的筛选

因为口服生物利用度(OB)是一种在药动学中作为药物吸收、分布、代谢、排泄的重要参数之一[12]；类药性(DL)代表着与已知化学药相比其成分的的相似性[12]，在常规情况下，口服生物利用度值和类药性值的高低与相关成分是否具备活性及活性的多少呈正相关。因此，选择丹参化合物中符合口服生物利用度≥30%和类药性≥0.18的化学成分作为活性成分及相关靶标蛋白[13]。

1.3.2 丹参靶标基因名的添加

利用UniProt数据库和Perl软件为筛出的靶标蛋白添加基因名。由于某些靶标可能在UniProt数据库中找不到相应的基因名，删除无法找到名字的靶标，故实际得到的靶标基因名可能会更少。

1.4 骨质疏松症疾病相关靶标的获取

利用“osteoporosis”作为关键词，搜索GeneCards数据库、人类孟德尔数据库(OMIM)的疾病相关靶标，得到骨质疏松症疾病相关靶标。

1.5 中药-疾病靶标的构建

利用R语言软件将骨质疏松症相关靶标与丹参靶标取交集，得到中药-疾病共同靶标的韦恩图，从中得到活性化合物与骨质疏松症的交集基因。

1.6 中药-成分-靶标-疾病调控网络的构建

将获得的丹参靶标和获得的中药-疾病共同靶标利用Perl软件分别进行映射，再使用Cytoscape软件进行绘图，得到中药-成分-靶标-疾病调控网络，其中节点的类型有中药、成分、中药-疾病靶标和疾病，最后，运用该软件的插件“Networkanalyzer”对上述网络的节点度值进行分析，其值越高，提示该节点在网络中更重要[14]。

1.7 中药-疾病靶标蛋白相互作用网络的构建与核心靶标的筛选

将中药-疾病靶标导入STRING数据库[15]，筛选条件为种属选择人，最小互作分数值为0.4，剔除图中孤立的蛋白质，最后输出PPI网络图，保存相应结果文件,将所得文件输入R语言计算靶标蛋白关联度值，根据degree度值从多到少绘制出为前30的核心靶标的条形图。

1.8 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

将中药-疾病靶标利用R语言软件计算，以富集数目多少及P值大小筛选出前20个GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果。以P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1 丹参中有效成分的筛选和靶标预测结果

通过对TCMSP数据库中丹参所有已报道的有效成分及其相关靶标筛选，共搜索到有效成分202个，相关靶标2566个。根据口服生物利用度和类药性参数对丹参的有效成分进行筛选，共获得主要活性成分65个，其对应的靶标932个，详见表1。

2.2 中药-疾病靶标构建的结果

利用R语言软件将骨质疏松症相关靶标与丹参靶标取交集，得到中药-疾病共同靶标的韦恩图(见图1)，从中得到中药-疾病共同靶标74个。其中骨质疏松症疾病相关靶标3264个，丹参相关靶标108个。

2.3 中药-成分-疾病-靶标调控网络构建的结果

由图2可见，中药丹参主要通过57种有效成分作用于74个靶标，这74个靶标可能影响骨质疏松症的发生(表1内65个丹参有效成分中，有8个成分无对应的骨质疏松症靶点)。利用“Networkanalyzer”对上述网络的节点度值进行分析，木犀草素(luteolin)、丹参酮IIa(tanshinoneiia)、隐丹参酮(cryptotanshinone)、二氢丹参内酯(dihydrotanshinlactone)的节点度值分别为42,28,16,15，可能为该网络中较为重要的有效成分。

2.4 中药-疾病靶标蛋白相互作用网络构建与核心靶标筛选的结果

基于蛋白质-蛋白质相互作用的关系，利用STRING数据库构建的丹参治疗骨质疏松症靶标的PPI网络图。其中节点表示靶标蛋白，每条边表示靶标蛋白与蛋白之间的相互作用关系(见图3)。

表1|通过TCMSP数据库对丹参全部成分根据口服生物利用度和类药性参数进行筛选后的结果

根据节点关联度值绘制出的前30的核心靶标的条形图(见图4)，由多到少依次为：AKT1、IL6、VEGFA、MAPK1、MYC、EGFR、FOS、JUN、STAT3、CASP3、PTGS2、CCND1、ERBB2、MMP9、BCL2L1、MAPK14、ESR1、RELA、AR、IL10、PPARG、MMP2、NR3C1、CASP9、CDKN1A、IL2、ICAM1、IL4、APP、HMOX1。其中AKT1、IL6、VEGFA度值较高于其他蛋白节点，说明这几个靶标蛋白可能在丹参治疗骨质疏松机制中起着重要作用。

2.5 GO功能富集分析

根据P值及富集数目筛选出前20个GO功能富集分析结果，主要涉及核受体活性、转录因子活性、类固醇激素受体活性、酰胺结合、肽结合、细胞因子受体结合、磷酸酶结合、蛋白磷酸酶结合、类固醇结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合等(见表2)。

柱状图：图形左侧字母是KEGG名称，下面数字是富集在KEGG上的基因数目，柱状图形表示富集在KEGG上的基因，P代表富集的显著性，颜色越红，富集的程度越高，相应的P值越小(见图5)。

气泡图：图形左侧字母是KEGG名称，下面数字是基因的比例，圆圈大小表示富集的基因数目，颜色代表P值，颜色越红，富集的程度越高，相应的P值越小(见图6)。

2.6 KEGG通路富集分析

根据P值及富集数目筛选出前20个KEGG通路富集分析结果，丹参治疗骨质疏松症的KEGG通路主要涉及：PI3K-Akt信号通路、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路、乙型肝炎通路、前列腺癌通路、内分泌抵抗通路、膀胱癌通路、小细胞肺癌通路、白细胞介素17信号通路、大肠癌信号通路、低氧诱导因子1信号通路、人巨细胞病毒感染信号通路、弓形虫病信号通路、胰腺癌信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、丙型肝炎信号通路、T细胞受体信号通路等(见表3)。

柱状图：图形左侧字母是KEGG名称，下面数字是富集在KEGG上的基因数目，柱状图形表示富集在KEGG上的基因，P代表富集的显著性，颜色越红，富集程度越高，相应的P值越小(见图7)。

气泡图：图形左侧字母是KEGG名称，下面数字是基因的比例，圆圈大小表示富集的基因数目，颜色代表P值，颜色越红，富集的程度越高，相应的P值越小(见图8)。

表2|GO功能富集分析结果

3、讨论

传统的中医理论是建立在“整体观念”基础上的，机体对疾病的内在调控是一个复杂的过程，单一靶标或单一信号通路并不能发挥很好的治疗效果，需要多靶点和多条信号通路相互协作才能更好地发挥药效[16]。此次研究通过检索TCMSP数据库和构建“丹参-成分-靶标-骨质疏松症”的网络图后发现，木犀草素、丹参酮IIa、隐丹参酮节点度值较高，可能为丹参治疗骨质疏松症网络中的重要成分。JING等[17]发现木犀草素可能通过调节GIO中的ERK/Lrp-5/GSK-3β途径，减轻氧化应激来促进小鼠成骨细胞分化和增殖。郭威等[18]在大鼠实验中发现丹参酮ⅡA通过激活转录因子Runx2，进而增强碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白、骨形态发生蛋白2等表达，从而能够起到加快成骨细胞的成熟、促进骨髓基质干细胞增殖、诱导骨髓基质干细胞分化成成骨细胞的功效，且随着丹参酮ⅡA浓度的增高呈正相关趋势。曾克勤等[19]在体外实验中发现隐丹参酮能显著抑制破骨细胞的分化发育(P<0.01)，且疗效呈剂量相关性，上述研究结果与此次研究基本一致，提示丹参有效成分具有一定的治疗骨质疏松症的作用。

PPI网络分析结果显示，丹参治疗骨质疏松症的核心靶标主要有AKT1(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1)、白细胞介素6、血管内皮生长因子A、丝裂原活化蛋白激酶(1MAPK1)等。其中，Akt信号可通过激活下游效应蛋白mTORC1/S6K1促进成骨细胞分化，并抑制其凋亡，从而起到调节骨代谢的目的[20]。CHEN等[21]在体外实验中也证实可通过Akt信号调节成骨细胞增殖和分化。白细胞介素6作为一种多效性细胞因子，对破骨细胞的分化和功能也有着重要影响[22]。血管内皮生长因子A作为血管内皮生长因子家族中的一员，其干预骨质疏松症的机制可能是通过刺激血管内皮，增强成骨细胞的活性以此促进成骨[23]。MAPKs是真核生物细胞内广泛存在的一类介导细胞反应的重要信号传导系统，它能受到生长因子、细胞因子、神经递质、激素等多种信号分子刺激后发生磷酸化而活化，活化的MAPK参与细胞增殖、分化、应激反应等生理过程[24]，徐会金[25]在体外培养人的巨噬细胞实验中发现MAPK可通过调控IRF-3来上调IFN-P基因的表达,从而起到抑制破骨分化,减弱骨吸收作用，对延缓骨质疏松症进程起着重要作用。

丹参治疗骨质疏松症的KEGG通路富集结果显示，主要富集在PI3K-Akt信号通路、乙型肝炎通路、前列腺癌通路、白细胞介素17信号通路、低氧诱导因子1信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、丙型肝炎信号通路等。磷脂酰肌醇三激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路作为细胞分化、增殖、迁移过程中一个重要的调节者，在骨质疏松病理过程中扮演着重要角色[26]，高润涛等[27]发现50g/L的丹参注射液具有促进人脱落乳牙牙髓干细胞细胞体外成骨/成牙分化的作用，并认为其机制可能与激活AKT信号通路有关。ADAPALA等[28]发现抑制PI3K/Akt信号通路活性，将使破骨细胞骨吸收能力减弱，从而达到延缓骨质疏松症进程的作用，其机制可能与激活下游的核因子kB受体活化因子(RANK)和巨噬细胞集落刺激因子受体(c-Fms)信号相关。

现有研究已证明，肝脏会影响骨骼健康，例如胰岛素样生长因子1和纤连蛋白，它可以通过产生细胞因子来激活骨活性激素，甚至可以代谢各种骨活性分子，从而缩短其半衰期，影响其循环水平或骨钙素活性，同时，病毒性肝炎患者骨质疏松症发生率显著增高，且与肝损害的程度呈正相关[29,30]。黄陈恕等[31]认为可能与慢性HBV感染诱导炎性因子的产生相关，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1和白细胞介素6，而这些炎症因子可通过增加核因子kB受体活化因子配体刺激破骨细胞和骨质吸收，此外，肿瘤坏死因子α还可抑制成骨细胞的分化、促进其凋亡。黄英等[32]研究也发现丙肝后肝硬化患者炎性反应介质白细胞介素6、肿瘤坏死因子α明显升高，可激活破骨细胞，促进骨吸收，从而导致骨质疏松的发生。

前列腺癌信号通路的下游通路主要包含凋亡信号通路，研究发现去势治疗前列腺癌能降低雄激素，同时经雄激素芳香化而来的雌激素也减少，雌激素通过调节核因子κB受体活化因子/核因子κB受体活化因子配体/骨质疏松症G通路，促进破骨细胞增殖、分化，促进骨吸收，从而导致骨质疏松[33,34]。由Th17细胞产生的白细胞介素17是一种重要的炎性因子，在破骨细胞分化过程中起着重要作用[35]。TYAGI等[36]研究发现外源性白细胞介素17可促进RANKL+M-CSF诱导的破骨细胞增殖和分化，提示白细胞介素17对破骨细胞的产生可能有直接刺激作用。刘海[37]发现白细胞介素17信号通路介导的炎性反应在类风湿关节炎并发骨质疏松的病理生理过程中具有重要调控作用，其机制主要是白细胞介素17通过诱导软骨产生一氧化氮合酶刺激滑膜组织高表达基质金属蛋白酶1,2,9,13，同时抑制蛋白聚糖和胶原对基质的修复作用，从而破坏细胞外基质和软骨合成。研究发现低氧诱导因子1信号通路也具有调控骨代谢的作用，可促进破骨细胞形成，增强其破骨活性，促进骨吸收[16]。

钟航等[38]证实了低氧诱导因子1信号通路参与了小鼠绝经后骨质疏松的病理演变过程，通过抑制低氧诱导因子1信号通路可延缓绝经后骨质疏松的进程，其具体机制可能与Akt、ERK、NFk这3条信号通路有关，但其确切的分子机制仍有待进一步研究。晚期糖基化终末产物是人体内蛋白质和碳水化合物之间的非酶促糖基化反应的产物，高血糖及衰老等因素可引起晚期糖基化终末产物在体内明显增高[39]。目前对骨重塑机制的深入研究，慢性炎症一定程度上参与了骨质疏松症的发展，而这种慢性炎症状态及相关的氧化应激可以通过激活晚期糖基化终末产物受体抑制WNT、ERK和PI3K信号抑制成骨细胞增殖[40,41]。有研究表明骨关节炎中软骨细胞拥有更高的晚期糖基化终末产物受体表达，激活的晚期糖基化终末产物受体通过活化软骨细胞内MAPK和核因子κB信号通路，促进软骨细胞的分解代谢。由此可见，糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路也有可能成为丹参治疗骨质疏松症的潜在靶点。

图1|中药-疾病靶标

图2|中药-成分-靶标-疾病调控网络

图4|中药-疾病核心靶标的条图

图5|GO功能富集分析柱状图

图3|中药-疾病靶标蛋白相互作用网络

图6|GO功能富集分析气泡图

图7|KEGG通路富集分析柱状图

图8|KEGG通路富集分析气泡图

表3|KEGG通路富集分析结果

综上所述，丹参治疗骨质疏松症的潜在有效成分主要包含木犀草素、丹参酮IIa、隐丹参酮等，这些成分可通过激活AKT1、白细胞介素6、血管内皮生长因子A、MAPK1等靶标蛋白，活化PI3K-Akt信号通路、白细胞介素17信号通路、低氧诱导因子1信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等通路直接或间接参与细胞分化和凋亡、代谢、氧化应激、炎症反应等途径发挥治疗骨质疏松症的作用，进一步证实了丹参可多成分、多靶标、多系统地作用于骨质疏松症，为后期丹参治疗骨质疏松症的药物研发及治疗提供一定理论依据，但是，上述结论及具体作用调节机制仍需进一步研究来验证。

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