日渐严重的环境问题如空气污染及重金属暴露是造成人体免疫力下降的重要原因[1,2,3]。免疫力低下会增加机体感染其他疾病的风险,例如慢性呼吸道疾病、心脑血管病、糖尿病和癌症等。现代医学认为由免疫器官、免疫细胞和免疫活性物质共同组成的机体免疫系统可调节免疫功能,从而有效地预防各种疾病的发生。中医认为,“正气内存,邪不可干”“邪之所凑,其气必虚”,即当病邪侵入人体后,正气会奋起抗邪,若正胜则邪退,疾病好转;若邪胜正衰,则疾病趋于恶化[1,2,3,4]。“正气”不仅包括人体正常的生理机能活动,还包括机体识别、抵御和清除各种有害因素的能力。因此,中医药理论认为免疫功能就属于“正气”的范畴[5]。

黄芪,为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[6,7]。作为临床常用的补气药,始载于《神农本草经》,具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津止渴、行滞通痹、托毒排脓、敛疮生肌的功效。现代临床上常用于治疗脾肺气虚所致之气虚乏力、咳喘气短、表虚自汗,中气下陷所致之久泻脱肛、内脏下垂,脾虚水湿失运导致的尿少水肿,气血不足所致之痈疮内陷、脓成不溃及久溃不敛、内热消渴、中风后遗症等[8,9]。

结合近些年国内外的研究报道,不难发现增强机体免疫功能已成为黄芪的主要药理活性[10,11]。但目前现有的研究中药及其复方的手段往往存在各种局限性,以至于难以科学地阐释其药效物质基础和作用机制。本文运用网络药理学对黄芪增强免疫功能机制进行多成分、多靶点的系统研究并结合氧化应激损伤细胞模型探讨其潜在的作用机制,为后续深入研究黄芪及含黄芪的中药复方增强免疫作用提供参考依据。

1、材料与方法

1.1网络药理学方法

1.1.1黄芪中活性成分的筛选和靶点预测

本研究通过检索中药系统药理学数据库和分析平台(TraditionalChineseMedicineSystemsPharmacologyDatabaseandAnalysisPlatform,TCMSP),对黄芪所有成分数据库进行了筛选,其中筛选条件为口服生物利用度(oralbioavailability,OB)≥30%、成药性(drug-likeness,DL)≥0.18;根据查找得到的成分在TCMSP预测黄芪相关活性成分作用的靶点。

1.1.2黄芪活性成分-靶点网络图的构建

基于Uniprot(https://www.uniprot.org/)数据库中的UniprotKB搜索功能,输入靶点名称并限定物种为人,将检索到的所有靶点蛋白校正为其官方名称。将黄芪有效成分及其对应靶点整理成Excel文件,导入Cytoscape3.7.1软件构建黄芪活性成分-靶点网络图。

1.1.3免疫疾病相关靶点的筛选

通过GeneCards(http://www.genecards.org/)数据库搜索与免疫关联的所有受体及基因信息,与上述活性成分-靶点进行对比分析,得到共同靶点,标记为黄芪活性成分增强免疫功能的潜在作用靶点。

1.1.4蛋白相互作用网络构建与分析

将上述潜在作用靶点采用String(https://string-db.org/)数据库进行PPI交互分析。通过限定物种为人,获取蛋白相互作用关系,将结果以TSV格式保存并导入Cytoscape3.7.1软件以完成相关网络构建。

1.1.5黄芪增强免疫作用的基因功能分析

使用Metascape(http://metascape.org/)数据库对黄芪活性成分增强免疫功能的对应靶点进行GO分析,设定物种为人、阈值P<0.01,并筛选前20条生物过程。

1.1.6黄芪增强免疫作用的通路分析

使用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)数据库对黄芪活性成分增强免疫功能的对应靶点进行KEGG分析,设定物种为人,并筛选排名靠前20条的通路。

1.2细胞实验验证

1.2.1细胞及试药

HepG2细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心;黄芪药材购于北京本草方源药业集团有限公司,经北京中医药大学张媛副教授鉴定为蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。

1.2.2细胞培养

将HepG2细胞置于DMEM完全培养基(含10%的胎牛血清,1%双抗)中培养。细胞培养条件为37℃恒温饱和湿度,5%CO2。

1.2.3MTT法检测HepG2细胞的存活率

取对数生长期的HepG2细胞,制备成密度为1×105个·mL-1的细胞悬液,接种于96孔板中,每孔100μL,培养24h使其完全贴壁。实验方法分为4组,空白组每孔加入100μL的DMEM完全培养基;模型组每孔加入100μL含有H2O2(20mmol·L-1)的DMEM完全培养基,损伤时间为1h。取黄芪粉末适量溶于甲醇中配制成100mg·mL-1母液待用。将100mg·mL-1的黄芪母液用DMEM完全培养基分别稀释成浓度为100、200μg·mL-1的工作液。黄芪组每孔分别加入含有100、200μg·mL-1的黄芪工作液的DMEM培养基预处理HepG2细胞24h后,吸出药物,后用20mmol·L-1H2O2浓度损伤HepG2细胞1h。待到达检测时间后,MTT法检测细胞存活率,存活率(%)=(实验组的OD值/空白组的OD值)×100%。

2、结果

2.1活性成分筛选和靶点预测

TCMSP数据库获得黄芪化学成分159个。根据设定OB和DL参数对黄芪中的活性成分进行筛选,共搜集得到17个活性成分,见表1。根据查找得到的成分在数据库中对上述活性成分进行作用靶点预测,共获得预测靶点457个。

表1根据OB和DL参数进行筛选所得黄芪有效成分

2.2活性成分-靶点网络的构建

在Uniprot数据库中筛选457个靶点蛋白对应的靶点基因,共得到451个靶点基因。将17个活性成分及其对应的451靶点信息导入到Cytoscape3.7.1软件中,构建活性成分-靶点网络图,见图1。其中节点(node)表示成分和靶蛋白,边(edge)表示成分与靶点之间的关系。网络图中总共153个节点,形成23256条边。图中黄色的圆形代表活性成分,粉色圆形代表靶点,靶点对应的成分越多,则表明该靶点相对重要性越高。

2.3免疫疾病相关作用靶点的筛选与预测

在GeneCards数据库中输入关键词immunity,检索到与免疫相关的靶点14978个。与上述活性成分-靶点进行对比分析,删除重复基因和假阳性基因后得到成分靶点136个,疾病靶点14978个。取两者交集部分,整合得到黄芪活性成分增强免疫功能的潜在作用靶点128个,见表2。

2.4蛋白相互作用网络的构建与分析

机体的内在调控往往不是由单一的信号通路所支配的,而是经过复杂的调控网络触发蛋白、基因靶点发挥直接或者间接的调节作用[12]。将String数据库得到的结果以TSV格式保存并导入到Cytoscape3.7.1软件绘制相互作用网络图。图中节点代表蛋白,边代表蛋白之间的关联性,通过设置Combinescore(结合率评分)和Degree(反映度值),调节边的粗细与节点大小和颜色,获得最终的蛋白相互作用网络。边越粗,Combinescore值越大;节点越大,颜色越深对应的Degree值越大,表明靶点与靶点之间的联系越紧密,活性成分作用于该靶点发挥增强免疫作用的几率就越大[13]。

表2黄芪增强免疫功能的相关靶点

进一步分析黄芪增强免疫功能的潜在作用靶点,发现网络图中共涉及128个节点,3702个边,说明黄芪在增强免疫功能方面可对128个靶点产生直接或间接的作用,并且这些靶点与靶点之间相互的联系多达3702种。其中,Degree值高于80的关键靶点包括前表皮生长因子(pro-epidermalgrowthfactor,EGF)、细胞肿瘤抗原p53(cellulartumorantigenp53,TP53)、雌激素受体(estrogenreceptor,ESR1)、表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)、转录因子AP-1(transcriptionfactorAP-1,JUN)、丝裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activatedproteinkinase8,MAPK8)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activatedproteinkinase1,MCPK1)等,见图2及表3。

2.5基因功能与通路分析

基于Metascape和DAVID数据库对黄芪活性成分增强免疫功能对应的靶点进行GO和KEGG分析,设定阈值P<0.01,筛选靠前的生物过程或通路。

GO富集分析(见图3)显示,黄芪增强免疫功能的靶点主要涉及细胞对药物的反应(cellularresponsetodrug)、细胞对氮化合物的反应(celluarresponsetonitrogencompound)、对有毒物质的反应(responsetotoxicsubstance)、有机环状化合物的细胞反应(celluarresponsetoorganiccycliccompound)、对无机物的反应(responsetoinorganicsubstance)、血液循环(bloodcircluation)、对外源物质的反应(responsetoxenobioticsubstance)、活性氧磷代谢过程(reactiveoxyfensprciesmetabolicprocess)等。

从KEGG通路分析结果(见图4)可以看出,这些靶点主要涉及一些cAMP信号相关通路(cAMPsignalingpathway)、钙信号通路(calciumsignalingpathway)、雌激素信号相关通路(estrogensignalingpathway)、配体受体相互作用通路(ligand-recptorinteraction)、癌症相关通路(pathwaysincancer)、Pl3K-Akt信号相关通路(Pl3K-Aktsignalingpathway)等。

表3黄芪增强免疫的关键靶点

图1黄芪活性成分-靶点相互作用网络图

图2蛋白-蛋白相互作用网络

图3预测靶点的GO富集分析

图4预测靶点的KEGG通路分析

2.6黄芪对H2O2诱导的HepG2的氧化损伤的影响

已有研究发现,随着增龄等原因,当出现体内氧化和抗氧化的不平衡现象时,氧化应激损伤机会不断增加,进而机体的免疫力也会随之而下降,间接增加机体感染各种疾病的机会[14,15],可见抗氧化与增强免疫力之间有着千丝万缕的关系。而目前尚缺乏直接的细胞模型来评价增强免疫力的作用,因此采用H2O2诱导的HepG2的氧化损伤模型能够从侧面验证黄芪增强免疫力的活性功能。

与空白组比较,经20mmol·L-1H2O2损伤的HepG2细胞存活率显著降低,细胞存活率的降低是H2O2对细胞造成不可逆损伤的充分体现。与模型组比较发现,经100、200μg·mL-1浓度的黄芪工作液预处理HepG2细胞24h后,其细胞存活率升高(见表4)。表明黄芪处理HepG2细胞能够改善由H2O2损伤引起的细胞凋亡或坏死。

表4黄芪对HepG2细胞存活率的影响(x±s,n=3)

3、讨论

人体免疫系统功能下降,会导致各种疾病发生发展。现代医学相关研究已证实,免疫功能主要是由机体的免疫系统发挥作用。免疫器官、免疫细胞和免疫活性物质是构成免疫系统的重要组成部分,能够识别和清除外来病原微生物及体内的突变细胞、衰老死亡细胞或其他有害成分,以保持机体健康、避免各种疾病的产生[16]。

许多中药及复方在增强免疫功能方面发挥着重要的作用。其中黄芪作为“补气之长”,能够补气升阳、利水消肿、托毒排脓,常用于气虚乏力、咳喘气短、尿少水肿。在增强免疫功能方面,中医更是认为黄芪能够扶助正气、抵御病邪。但是其发挥作用的药效物质基础和分子机制至今尚不明确。因此,分析黄芪的有效活性成分和作用靶点,揭示其增强免疫功能的作用机制,有利于科学阐述黄芪的医学内涵,促进其实际临床应用。

本文根据设定OB和DL参数范围,从TCMSP数据库中筛选出17个满足条件的黄芪有效的活性成分,并从Uniprot数据库中检索到451个有关的靶点基因,绘制出了黄芪活性成分-靶点相互作用网络图。结果表明,黄芪的有效活性成分主要为黄酮类化合物,例如毛蕊异黄酮、槲皮素、芒柄花素、异鼠李素、9,10-二甲氧基紫杉醇-3-O-β-D-葡萄糖苷、5'-羟基异微凸剑叶莎醇-2',5-二-O-葡萄糖苷。黄酮苷和黄酮苷元作为黄芪化学成分中的重要组成部分,已有大量文献报道这些成分具有免疫调节、抗损伤、抗肿瘤和抑制动脉粥样硬化形成等多种活性[7,17]。

凭借GeneCards数据库检索到与免疫相关的靶点14978个和上述活性成分-靶点两部分信息,通过取两者交集部分的靶点,整合得到黄芪活性成分增强免疫功能的潜在作用靶点128个。凭借蛋白-蛋白相互作用网络图进一步深入分析,黄芪在增强免疫方面可对128个靶点产生直接或间接的作用,并且这些靶点与靶点之间相互的联系多达3702种。EGF、TP53、ESR1、EGFR、TNF、JUN、MAPK8、IL-6、MAPK1、NOS3、IL-1β、NR3C1、PTGS2、MAPK14、PPARG等是黄芪增强免疫作用的主要作用靶点。这些靶点主要涉及细胞过程,对有毒物质、外源物质的反应过程,血液循环过程和活性氧磷代谢过程等,特别是涉及免疫细胞的生长、分化过程。免疫调节功能的发挥是信号分子、转录因子、受体、蛋白和酶等多种无机物、有机环状化合物及氮化合物共同参与的复杂的生物学过程。

例如,IL-1β是极其重要的调节免疫反应的细胞因子,它们在免疫细胞的成熟、活化、增殖和分化等一系列过程中均有重要作用,此外还能够参与传递信号,调节炎症反应等。IL-6作为一种具有多效性的细胞因子,是由间质细胞、造血细胞、上皮细胞等多种细胞产生的[18,19],其通过刺激产生抗体,促进T细胞的生长、诱导T效应细胞发育,在获得性免疫应答过程中作用巨大[20]。TNF作为一种调节细胞因子,在免疫系统中对蛋白质的信号传递起着至关重要的作用,能够组织免疫细胞与免疫细胞之间进行信息交流[21]。有研究报道MAPK1可以正向调控IL-1β及TNF-α的表达及分泌[22],MAPK1、MAPK14等也能共同介导T、B细胞的生长、分化,调节炎症,参与对环境的应激反应。有研究发现,JUN在T细胞依赖或T细胞不依赖两种类型的B细胞活化过程中均发现有Fos/Jun蛋白质水平的升高。另外,免疫球蛋白内均有JUN的反式激活位点,表明其极有可能参与B细胞的活化和免疫球蛋白产生的调控。此外,JUN还能与NR3C1相互作用,参与机体炎症反应和免疫反应[23,24]。ESR1不仅对生殖系统有着不可或缺的作用,对包括免疫系统在内的其他方面也有重要影响。已有研究表明,雌激素可参与调节体液免疫和细胞免疫;其含量或功能的失调会导致一些自身免疫性疾病的发生[25]。

对靠前的生物过程或通路进行基因功能与通路分析,发现黄芪增强免疫功能涉及的通路主要有钙信号通路、TNF信号通路、配体受体相互作用通路、Pl3K-Akt信号相关通路和癌症相关通路等。其中,钙离子在免疫信号传导过程中具有重要作用,当免疫受体被激活,细胞质中的钙离子浓度就会大幅增加。这可能是由于在钙信号通路中蛋白激酶迅速激活免疫受体致使钙离子发生内流,而这一介导作用对于免疫应答和抗病性是不可或缺的。也有研究[26]从基因组水平上刻画文昌鱼的免疫系统,进而揭示了脊椎动物免疫系统的起源,并推测TNF信号通路的激活可能来源于宿主防御系统对信号调节的需要,其相关作用机制可能是依靠一种小型的四次跨膜蛋白tetraspanin,它能够影响各种免疫相关蛋白在膜上形成功能微结构域(如免疫突触等),以组织者的身份参与调节这些蛋白。另外还有研究报道[27],雌激素通过与G-蛋白偶联受体结合,从而诱导MAPK和P13K信号通路,在自身免疫缺陷性小鼠中,能够降低心脏重塑,减轻心力衰竭。

同时,本文还利用20mmol·L-1H2O2诱导HepG2细胞1h的损伤模型,借助MTT检测细胞存活率。结果表明,黄芪提取液能部分逆转H2O2诱导的HepG2细胞损伤,提高其细胞存活率。从侧面验证了黄芪有可能能通过抗氧化来抵抗机体衰老过程,从而增强机体免疫力。

综上所述,本文选择黄芪作为模型药物,运用网络药理学对其增强免疫功能的潜在作用机制进行了系统的讨论,涉及多种成分、靶点、过程、分子和通路,可较为全面地揭示黄芪增强免疫功能的作用机制。与此同时也通过氧化应激损伤细胞实验验证了部分结论,但围绕靶点、通路的相关验证工作仍需要进一步展开。

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