特应性皮炎（atopicdermatitis,AD）是一种常见的慢性、炎症性、复发性皮肤病，临床以皮肤干燥、皮炎改变及剧烈瘙痒为特点。在过去几十年中，特应性皮炎的发病率明显增加，尤其儿童发病率高达10%～20%[1]，且该病终生患病率高达34.1%[2]，整个病程跨越儿童期、青少年期直至成年期，给患者带来持久的生理和心理的双重损害，严重影响患者生命质量。现代医学认为本病与遗传、免疫、感染、屏障功能等相关，治疗主要是抗炎抗过敏、调节免疫、恢复皮肤屏障等，但疗效均有局限性。中医学中特应性皮炎属于“四弯风”范畴，现代医家对特应性皮炎的辨证分型虽存在一定争议，但在病机方面多认同该病与心、脾两脏关系最为密切，故清心火，健脾胃是临床特应性皮炎主要治法之一[3]。

培土清心颗粒是广东省中医院皮肤科针对特应性皮炎研发的中药颗粒剂，其理论基础来源于陈达灿教授临证治疗特应性皮炎凝练的培土清心法。临床实践证明，培土清心颗粒能有效改善特应性皮炎患者皮损严重程度、控制瘙痒、提高生活质量[4]。该制剂由白术、连翘、白茅根、太子参、薏苡仁、山药、珍珠粉、白鲜皮、甘草9味中药组成，全方紧扣病机，轻灵平正，清而不伤正，养而不留邪，共奏健脾清心，祛风止痒之功，主要用于心火脾虚型特应性皮炎。前期动物实验[5,6,7,8]发现，培土清心颗粒可降低DNCB介导的肥大细胞诱导，减轻耳背皮肤炎症细胞的浸润，降低特应性皮炎小鼠脾脏Th2细胞的表达，刺激调节性B细胞增殖，从而抑制炎症反应，调节免疫平衡，改善病情。特应性皮炎的病机十分复杂，中药复方治疗存在多途径、多靶点、多效性等特点，故为进一步探索培土清心颗粒治疗特应性皮炎的作用机制，本研究基于网络药理学和模块分析对其主要有效成分、重要作用靶点、信号通络等方面进行分析。

1、材料和方法

1.1培土清心颗粒潜在活性成分及靶点的筛选

通过检索中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP)(http：//tcmspw.com/tcmsp.php）收集培土清心颗粒中（除珍珠粉外）每味中药的化合物成分；设置ADME参数，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18进行筛选，得到潜在活性成分；检索潜在活性成分的靶点蛋白，并在Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）将预测出的靶点蛋白名转换为基因名。检索BATMAN-TCM数据库（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）收集珍珠粉的化合物成分及靶点蛋白，合并数据即得到培土清心颗粒潜在活性成分的预测作用靶点。

1.2特应性皮炎疾病靶点的获取

以“atopicdermatitis”“dermatitis,atopic”为检索词分别在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）、OMIM数据库（https：//www.omim.org/）、DisGeNET数据库（https：//www.disgenet.org/）中进行检索，对获取的结果整合、去除重复后得到特应性皮炎的疾病靶点。

1.3培土清心颗粒潜在活性成分-靶点-疾病网络的构建及拓扑分析

将培土清心颗粒潜在活性成分的预测作用靶点与特应性皮炎疾病靶点导入OmicShare平台（https：//www.omicshare.com）进行映射，得到培土清心颗粒治疗特应性皮炎的潜在作用靶点。将其与上述活性成分导入网络图像可视化软件Cytoscape3.7.1中，绘制培土清心颗粒潜在活性成分-靶点-疾病网络图。然后用NetworkAnalyzer插件对网络进行拓扑分析，通过自由度（Degree）、介数（BetweennessCentrality）、接近中心性（ClosenessCentrality）对活性成分的重要性进行评估。

1.4蛋白质相互作用（PPI）网络构建及拓扑分析

将培土清心颗粒治疗特应性皮炎的潜在作用靶点导入String数据库（https：//string-db.org/），物种设置为“Homosapiens”，阈值设置为“mediumconfidence=0.9”，构建培土清心颗粒治疗特应性皮炎的靶点蛋白相互作用（PPI）网络。

1.5蛋白模块分解及拓扑分析

运用Cytoscape软件中的clusterMaker插件将培土清心颗粒治疗特应性皮炎的潜在靶点进行模块化分解，然后利用NetworkAnalyzer插件对网络进行拓扑分析，通过自由度（Degree）、介数（BetweennessCentrality）、接近中心性（ClosenessCentrality）对各模块靶点的重要性进行评估。

1.6基因百科全书（KEGG）通路富集分析

将各个模块的靶蛋白导入DAVID6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）分别进行KEGG通路富集分析，然后将KEGG通路富集信息导入OmicShare平台绘制四维气泡图进行展示，通过对不同模块基因的富集分析预测培土清心颗粒治疗特应性皮炎的可能机制。

2、结果

2.1培土清心颗粒潜在活性成分收集及靶点预测结果

按口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18筛选后，共得到培土清心颗粒潜在活性成分185个（白术7个，连翘23个，白茅根4个，太子参8个，薏苡仁9个，山药16个，珍珠粉8个，白鲜皮18个，甘草92个），将上述潜在活性成分逐一对应靶点并在Uniprot数据库中转换基因名，共得到263个靶点，即培土清心颗粒潜在活性成分的预测作用靶点。

2.2特应性皮炎疾病靶点收集结果

在GeneCards、OMIM、DisGeNET数据库中分别检索到1256、36、483个疾病靶点，整合数据、去除重复后共得到1387个靶点。

2.3培土清心颗粒潜在活性成分-靶点-疾病网络构建和分析结果

将263个活性成分预测作用靶点与1387个特应性皮炎疾病靶点导入OmicShare平台进行映射，得到活性成分-疾病交集靶点125个，即培土清心颗粒治疗特应性皮炎的潜在作用靶点。将潜在活性成分和靶点导入Cytoscape3.7.1软件构建培土清心颗粒潜在活性成分-靶点-疾病网络，见图1。图中培土清心颗粒包含众多潜在活性成分，一个潜在活性成分可对应多个靶点，特应性皮炎对应众多靶点，一个靶点也可与多个潜在活性成分相对应，充分体现培土清心颗粒治疗特应性皮炎的作用机制是多成分、多靶标、多通路的特点。根据拓扑学指标自由度（Degree）、介数（BetweennessCentrality）、接近中心性（ClosenessCentrality）的大小对潜在活性成分进行筛选，共得到11个重要活性成分，分别是檞皮素、木犀草素、山奈酚、汉黄芩素、柚皮素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、β-谷甾醇、芒柄花素、甘草查尔酮A、灯盏花素和豆甾醇，推测可能是培土清心颗粒治疗特应性皮炎的关键化合物，详细信息见表1。

2.4PPI网络构建结果

将培土清心颗粒治疗特应性皮炎的潜在作用靶点导入String数据库并设置阈值为0.9，获取PPI网络，见图2。共包含125个节点，510条边。

图1培土清心颗粒潜在活性成分-靶点-疾病网络

表1培土清心颗粒关键化合物信息

2.5蛋白模块分解与分析

ClusterMaker是一个将许多集群算法与多个查看选项相结合的聚类分析工具。蛋白模块分解结果显示，125个靶点分成3个模块，见图3。其中模块一含24个，模块二含53个，模块三含47个，靶点SEC14L2基本无关联，未予以分类。最后根据拓扑学指标（同上）分别对各个模块的靶点进行筛选，模块一综合排位前4名的靶点是PTGS2、CXCL8、IL-10、CCL2；模块二综合排位前3名的靶点是MAPK3、VEGFA、JUN；模块三综合排位前3名的靶点是IL-6、AKT1、IL1B。说明这些靶点在各个模块中具有核心地位，提示这些靶点在培土清心颗粒治疗特应性皮炎作用机制中具有重要意义，详细信息见表2。

图2培土清心颗粒治疗特应性皮炎靶点的PPI网络

图3培土清心颗粒治疗特应性皮炎靶蛋白模块分解

2.6基因百科全书（KEGG）通路富集分析结果

分别对3个模块内的靶点进行KEGG通路富集分析，设定阈值P<0.05。结果模块一靶点共得到KEGG信号通路55条，主要富集在疾病及相关信号通路上，如TNF信号通路、NF-κB信号通路、T细胞受体信号通路、趋化因子信号通路、干扰素γ信号转导、细胞因子网络、疟疾、利什曼病、甲型流感、炎症性肠病等，根据P值排序取前20条通路进行绘图分析（图4）；模块二靶点共得到KEGG信号通路220条，主要富集在癌症及相关信号通路上，如HIF-1信号通路、ErbB信号通路、PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、促性腺激素释放激素信号通路、催乳素信号通路等，根据P值排序取前20条通路进行绘图分析（图5）；模块三靶点共得到KEGG信号通路51条，主要富集在代谢及相关信号通路上，如药物代谢-细胞色素P450、HIF-1信号通路、色氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、酪氨酸代谢、5-羟色胺能突触、核受体转录途径等，根据P值排序取前20条通路进行绘图分析（图6）。KEGG通路富集分析结果显示，培土清心颗粒活性成分靶点分布在不同的通路上，提示培土清心颗粒可以通过多通路协调发挥治疗作用。

表2培土清心颗粒治疗特应性皮炎各蛋白模块关键靶点信息

3、讨论

培土清心颗粒潜在活性成分-靶点-疾病网络拓扑学分析显示，檞皮素、木犀草素、山奈酚、汉黄芩素、柚皮素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、β-谷甾醇、芒柄花素、甘草查尔酮A、灯盏花素和豆甾醇可能是培土清心颗粒治疗特应性皮炎作用的关键化合物。研究[9]表明，槲皮素具有很强的抗炎能力，能通过诱导Th1衍生的细胞因子IFN-γ和抑制Th-2衍生的细胞因子IL-4发挥有益免疫刺激作用。木犀草素可降低血清IgE和IL-4水平，减少表皮水分流失并增加皮肤水分，在皮肤中表现出较强的抗异位性皮炎活性[10]。柚皮素能明显抑制特应性皮炎小鼠M1样巨噬细胞表型、HMGB1级联反应和炎性细胞因子水平，通过将M1表型转换为M2表型，激活抗炎基因表达[11]。甘草查尔酮A在体内外均能明显下调TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，发挥有效的抗炎作用[12]。其他化合物如山奈酚[13,14]、汉黄芩素[15]、芒柄花素[16]虽被证明有有效的抗炎特性，但在特应性皮炎中的研究较少。而β-谷甾醇、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、灯盏花素和豆甾醇对特应性皮炎的治疗作用尚未得到证实，这为培土清心颗粒治疗特应性皮炎的作用机制给出了新的化合物预测。

图4模块一靶点的KEGG分析结果气泡图

模块分解及拓扑学分析结果显示，培土清心颗粒主要通过PTGS2、CXCL8、IL-10、CCL2、MAPK3、VEGFA、JUN、IL-6、AKT1、IL-1β等靶点达到治疗特应性皮炎作用。PTGS2在炎症中起重要作用，是特应性皮炎的重要基因靶点[17];IL-6通过T细胞上的单核细胞聚集、血管增生和抗凋亡功能放大慢性炎症过程环路[18,19,20]，在特应性皮炎慢性期表达水平升高；IL-10限制炎症反应，调节T淋巴细胞，在特应性皮炎急性期表达升高[21,22];AKT1活性或表达的丧失能导致角质形成细胞微丝聚集蛋白加工减少，使特应性皮炎皮肤屏障功能受损[23];IL-1β促进表达IL-1R1的肥大细胞过度活化，在皮肤屏障受损小鼠慢性特应性皮炎样炎症中起关键作用[24]；而CXCL8[25]、CCL2[26]、VEGFA[27]、JUN[28]均在特应性皮炎中检测到高表达，被证实是特应性皮炎的重要靶点；但其他关联性较高的靶点如MAPK3在特应性皮炎中的作用和地位尚未得到确切的证实。上述基因可能是培土清心颗粒发挥治疗特应性皮炎作用的重要靶点，这给培土清心颗粒治疗特应性皮炎作用机制的研究提供了进一步的方向。

图5模块二靶点的KEGG分析结果气泡图

网络模块化分析有助于深入挖掘中药复方治疗疾病的途径和通路。本研究结果表明，培土清心颗粒治疗特应性皮炎作用靶点主要分为3个模块。模块一内靶点KEGG通路主要与特应性皮炎免疫系统、炎症反应相关。如培土清心颗粒治疗特应性皮炎的交集基因有7个富集在NF-κB信号通路上，该通路具有抗凋亡作用，可被炎症、自身免疫性疾病、感染和癌症激活[29]，当特应性皮炎炎症过程建立后，细胞因子与附近的血管内皮细胞受体结合，就会导致NF-κB信号级联激活[30]，促进大量炎性因子表达。有研究证明，通过灭活核因子-κB[31]或阻断NF-κB信号通路[32]可以改善特应性皮炎症状。而槲皮素能通过增加过氧化物酶体和增殖物激活因子受体c(PPARγ）的活性，从而拮抗NF-κB或激活蛋白-1(AP-1）转录激活炎症基因，进而间接预防炎症[9]。甘草查尔酮A能通过抑制NF-κB活化以剂量依赖的方式发挥抗炎作用[12]。T细胞受体信号通路、干扰素γ信号转导以及趋化因子信号通路均与特应性皮炎炎症与免疫反应密切相关。模块二内靶点KEGG通路主要与细胞增殖、分化、凋亡相关。PI3K-Akt信号通路及ErbB信号通路[33]均参与并调控细胞增殖、分化、凋亡等活动，富集在PI3K-Akt信号通路上的交集基因有20个，其中EGFR和ErbB2在一项全基因组研究中显示在特应性皮炎病变皮肤中表达降低，结论提示EGFR的抑制可能通过调节炎性趋化因子参与特应性皮炎的发病[34]；通过下调PI3K/AKT的下游信号通路可抑制肥大细胞衍生的过敏性炎症反应[35]。研究[36]发现，木犀草素通过抑制PI3K/AKT途径，在减轻脂多糖诱导的炎性级联反应中发挥重要作用。HIF-1信号通路在生物发育、代谢、贫血、损伤修复等生理和病理生理过程中具有重要生物学意义[37]，在过敏性皮炎中，通过下调HIF-1α的表达可修复紧密连接[38]。模块三内靶点KEGG通路与代谢密切相关，尤其是氨基酸的代谢如色氨酸、精氨酸、脯氨酸、酪氨酸密切相关。有研究[39]发现在IgE正常的特应性皮炎儿童中氨基酸代谢异常，尤其是精氨酸明显减少，而精氨酸是一氧化氮（NO）的前体，NO是神经传递、炎症和免疫反应的信号分子，已有研究表明NO在特应性皮炎中起重要作用。色氨酸代谢途径是具有免疫调节能力的一种途径[40]，皮肤微生物组衍生的色氨酸代谢产物吲哚-3-醛（IAId）对特应性皮炎患者的皮肤炎症反应具有负调控作用，提示色氨酸降解途径可能在特应性皮炎的病理生理中起重要作用[41,42]。在慢性特应性皮炎皮肤病变中，小脯氨酸富集区（SPRR）蛋白1A和2C的RNA过度表达，与特应性皮炎慢性皮肤病变的持续存在可能相关[43]。

图6模块三靶点的KEGG分析结果气泡图

由此预测，培土清心颗粒治疗特应性皮炎的主要途径是：抗炎、调节免疫、调控细胞凋亡以及调节氨基酸代谢。这说明培土清心颗粒治疗特应性皮炎是多途径、多功效的。

综上所述，培土清心颗粒可能通过檞皮素、木犀草素、山奈酚、汉黄芩素、柚皮素等多种活性成分作用于PTGS2、CXCL8、IL-10、IL-6、AKT1、IL-1β等关键靶点，通过调控NF-κB、PI3K-Akt、HIF-1、ErbB及氨基酸代谢等多条通路，参与抗炎、调节免疫、调控细胞凋亡以及调节氨基酸代谢等方面，发挥治疗特应性皮炎的作用。下一步可将培土清心颗粒关键的活性成分、靶点和通路作为实验方向对培土清心颗粒的疗效机制进行验证，这也将为培土清心颗粒的临床运用和特应性皮炎的治疗提供新的思路和参考。

参考文献：

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