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自拟参藤三黄汤治疗糖尿病肾病网络药理学研究

2024-01-18 86 上传者：管理员

摘要：目的：基于网络药理学研究方法，探究自拟参藤三黄汤治疗糖尿病肾病的可能作用机制。方法：利用中药系统药理学数据库和分析平台筛选自拟参藤三黄汤的生物活性成分，并预测其靶点，应用Genecards数据库分别收集糖尿病肾病的疾病靶点，利用在线韦恩图绘制平台对自拟参藤三黄汤与糖尿病肾病的靶点进行映射，运用STRING平台及Cytoscape软件构建蛋白相互作用网络，筛选获得核心靶点；进一步进行京都基因与基因组百科全书通路富集和基因本体富集分析，探究可能的生物过程与信号通路；应用Cytoscape软件筛选自拟参藤三黄汤治疗糖尿病肾病的关键成分，并构建“药物-成分-靶点-通路”网络。结果：预测得到自拟参藤三黄汤治疗糖尿病肾病的关键成分是钙、酪氨酸、谷胱甘肽、丝氨酸、类黄酮类物质等；核心靶点是ESR1、TP53、SP1、STAT3等19个靶点。GO和KEGG富集分析结果显示，自拟参藤三黄汤治疗糖尿病肾病主要涉及蛋白质摄取、紫外线反应、细胞对氧化应激的反应、转录调节复合体、周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合体、磷酸酶绑定、蛋白磷酸酶结合、HIF1信号通路、甲状腺激素信号通路、HIF1信号通路等多个信号通路和靶点。结论：自拟参藤三黄汤治疗糖尿病肾病具有“多成分-多靶点-多途径”的特点与优势，本研究为进一步研究自拟参藤三黄汤治疗糖尿病肾病的物质基础与分子机制提供了理论依据。

关键词：
糖尿病
糖尿病肾病
网络药理学研究
自拟参藤三黄汤
药理学
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糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)常见而难治的慢性微血管并发症，也是导致慢性肾功能衰竭的重要原因之一。现代医学对DN尚缺乏有效的治疗方法。笔者认为，DN发病源于脾肾亏虚，以水湿浊毒瘀阻为标，其临床表现多与《伤寒论》少阴证相似，故以健脾利湿祛瘀为主，自拟参藤三黄汤(黄芪、黄连、生地黄、丹参、鸡血藤、枸杞子、山萸肉、山药)治疗糖尿病肾病，并取得较好的疗效[1,2]。本文从网络药理学的角度探讨参藤三黄汤治疗DN的作用机制。

1、材料与方法

1.1 自拟参藤三黄汤有效成分与潜在靶点筛选

通过Symmap网站[3]获得参藤三黄汤的成分以及成分所对应的靶点，过滤错误的成分、靶点名称。

1.2 参藤三黄汤药物-成分-靶点网络构建

使用自动化软件对成分重新编码，汇总参藤三黄汤中9种药物的成分与靶点，构建药物-成分-靶点网络，使用Cytoscape 3.9.1软件进行网络分析，可得出各个要素的自由度值(Degree)。

1.3 DN靶点的收集及药物-疾病共同靶点的筛选

以“diabetic nephropathy”作为关键词，录入GeneCards、DisGeNET[4]等在线数据库网站查询靶点，获取与DN相关靶点后去重，使用Evenn[5]绘制韦恩图，获得参藤三黄汤与DN的共同靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建

将参藤三黄汤与DN的相同靶点提交String数据库[6]获得参藤三黄汤-DN共同靶点的蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI Network),并使用Cytoscape 3.8绘制网络图。

1.5 DN靶点的收集及药物-疾病核心靶点的筛选

利用Cytoscape 3.8软件对于PPI网络进行网络分析，利用自由度值(Degree)、中介中心性(BC)、紧密中心性(CC)对共同靶点进行筛选，筛选标准为共同靶点Degree、BC、CC三值的中位数以上，循环上述操作直至靶点数量低于60个为止。

1.6 基因本体论和京都基因组百科全书富集分析

通过微生信bioinformatics在线平台，针对核心靶点进行基因本体论(GO)和京都基因组百科全书(KEGG)富集分析，获得的数据以图表形式展现。

2、结果

2.1 参藤三黄汤有效成分与潜在靶点查询与筛选结果

筛选9味药物有效成分共计621个，靶点3569个，每味中药的成分数量分别如下：黄芪218个、黄连133个、生地黄69个、葛根78个、丹参251个、鸡血藤98个、枸杞子117个、山萸肉128个、山药72个，共有成分有271个。

2.2 参藤三黄汤药物-成分-靶点网络

参藤三黄汤药物-成分-靶点网络分析，发现参藤三黄汤中的一些重要成分是钙、酪氨酸、谷胱甘肽、丝氨酸、类黄酮类物质等。

2.3 DN靶点的收集结果及参藤三黄汤-DN共同靶点结果

在GeneCards数据库中发现3663个DN疾病靶点，在DisGeNET数据库中发现1058个DN靶点。二者合并去重后，共计3930个DN靶点。通过比对参藤三黄汤和DN的靶点，发现共同靶点1361个，韦恩图如图1所示，左侧为参藤三黄汤靶点数量，右侧DN靶点数量。

2.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建

通过蛋白质-蛋白质相互作用网络分析后，并且按照Degree值的大小来决定靶点。获得896个点，2965条边。确定EGFR、TP53、CTNNB1、CREBBP、HIF1A等靶点为Degree值较高的靶点。

2.5 核心靶点筛选结果

通过1.5的方法，最终筛选出雌激素受体(ESR1)、TP53、SP1、STAT3等19个靶点，筛选出这些靶点的依据为Degree≥14、BC≥0.017 267、CC≥0.571 429。核心靶点PPI网络如图2所示，该图有19个点、78条边。该图中颜色越深表示Degree值越大，而ESR1、TP53、EGFR为Degree值较高的靶点。

2.6 基因本体论和京都基因组百科全书富集分析

经GO富集分析，发现有生物学过程2128条，包括蛋白质摄取、紫外线反应、细胞对氧化应激的反应等；细胞组成部分164条，包括转录调节复合体、转移酶复合物、转移含磷基团、周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合体等；细胞功能162条，包括磷酸酶绑定、蛋白磷酸酶结合、组蛋白脱乙酰酶结合甲状腺激素信号通路、FoxO信号通路等(图3)。

图1 参藤三黄汤-糖尿病肾病共同靶点示意图

图2 核心靶点蛋白质-蛋白质相互作用展示图

KEGG分析结果获得169条通路，包括内分泌阻力、HIF1信号通路、甲状腺激素信号通路、HIF1信号通路等信号通路。

图3 GO富集分析获得的生物学过程

3、讨论

DN是DM常见而难治的慢性微血管并发症，也是导致慢性肾功能衰竭的重要原因之一。近年来临床研究显示，中药及中药复方可有效地改善患者的临床症状，减轻患者的DN损伤。

DM属于中医学“消渴”“肥胖”范畴，消渴日久则生它变，一则阴损及阳，阴阳俱损；二则病久入络，血脉瘀滞；三则损伤脾胃，痰饮内生，耗伤气阴。这与现代医学发现糖脂代谢紊乱导致糖基化终末代谢产物出现、内皮细胞损伤、增加肾小球基底膜通透性、损伤血管，从而造成肾小球硬化的病理过程基本契合。可见，久虚是DN的发病基础，邪实则是指糖尿病及其并发症等[7]。

参藤三黄汤具有益气化瘀、清热生津、补肾固精功效。临床和实验研究均表明，参藤三黄汤治疗DM以及DN均具有较好的效果，但其作用机理尚未得到系统的研究。

根据网络药理学的综合研究表明，ESR1、TP53、EGFR靶点在参藤三黄汤治疗糖尿病及DN中发挥重要的作用。ESR1为编码雌激素受体和配体激活的转录因子，该蛋白质定位于细胞核，可能与雌激素受体2形成同二聚体或异二聚体。该基因编码的蛋白质调节许多雌激素诱导基因的转录，这些基因在生长、新陈代谢、性发育、妊娠和其他生殖功能中表达，并在许多非生殖组织中表达，该基因编码的受体在乳腺癌、子宫内膜癌和骨质疏松症中起着关键作用。近来发现，下丘脑中基层的葡萄糖敏感神经元及其表面高表达的FGFR1是介导FGF持久控糖的关键靶标。下丘脑中基层是包括腹中侧核、下丘脑弓状核脑区的重要代谢调控枢纽，存在阿黑皮素原、下丘脑刺鼠肽基因相关蛋白及ESR1等一系列参与摄食和血糖调控的神经元亚型和神经环路。TP53基因即P53,是一种抑癌基因，该基因编码是一种分子量为53kDa的蛋白质。有研究发现，在DM的实验鼠β细胞中，由于过量摄取糖和脂肪，应激反应加剧，p53 蛋白质出现增加。目前已经证实，p53与癌症、代谢综合征的关系密切，这为理解p53参与代谢调控提供了参考[8]。EGFR是明星分子，目前越来越多的文献报告建议将eGFR和UACR检测指标用来评估DM受损部位、潜在病因及病理生理过程[9]。

本研究运用网络药理学研究方法从成分、靶点、通路不同层次进行了预测，结果表明，参藤三黄汤可通过“多成分多靶点多途径”发挥对DM及DN的治疗作用，为进一步实验研究和临床治疗提供了新的理论依据。

参考文献:

[1]周小琳,李梦华.参藤三黄汤合葛根芩连汤治疗糖尿病肾病39例临床观察[J].国医论坛,2020,35(4):41-43.

[2]吴星霖.参藤三黄汤合葛根芩连汤治疗肾虚血瘀型糖尿病肾病临床观察[J].中国中医现代远程教育,2023,21(12):90-92.

[8]陈珂,丁艳平,王建林,等.p53参与代谢调控的研究进展[J].生物技术通报,2016,32(11):52-58.

[9]张俊清,苏白海,张捷,等.糖尿病肾脏病早期预测与诊断专家共识[J].中华内科杂志,2021,60(6):522-525.

基金资助:2022年河南省重点研发与推广专项(2221102310519);2021年河南省高等学校重点科研项目计划(22B360013);

文章来源:周小琳,张晓星,余小波等.自拟参藤三黄汤治疗糖尿病肾病网络药理学研究[J].国医论坛,2024,39(01):69-71.