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基于网络药理学与分子对接技术探讨青蛇方外用治疗湿疹的作用

2024-03-01 60 上传者：管理员

摘要：目的：基于网络药理学与分子对接技术探讨青蛇方外用治疗湿疹的作用机制。方法：应用TCMSP和UniProt数据库平台查询青蛇方组方的有效活性成分及靶基因，与疾病靶基因取交集后构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络；应用DAVID数据库，对潜在核心作用靶点基因进行基因本体(GO)功能、京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。利用分子对接原理论证青蛇方生物活性成分与核心靶点的分子结合能力。结果：筛选出青蛇方有效成分63种，作用靶点99个；主要有β-谷甾醇、2,4,7-三羟基-9,10-二氢菲、靛蓝素、豆甾醇、色氨酸等关键成分；转录因子AP-1(JUN)、肿瘤坏死因子(TNF)、原癌基因(RELA)、干扰素γ(IFNG)、转化生长因子-β1(TGF-β1)等核心基因。关键信号通路有癌症信号通路、恰加斯病通路、弓形体病通路、脂质和动脉粥样硬化通路等，分子对接结果显示活性成分与核心靶点基因结合能力较强。结论：青蛇方外用可以通过多种活性成分、多种通路有效抑制免疫炎症反应，促进免疫系统正常运行，从而达到治疗湿疹的目的。

关键词：
作用机制
分子对接
湿疹
网络药理学
青蛇方
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湿疹是一种可通过多种内在、外界因素所诱导的，可产生明显渗出倾向的皮肤炎症反应性疾病[1],临床多以多形损害、对称分布、瘙痒、渗出倾向、易反复发作等为特征[2]。西医治疗多采用口服抗组胺药，加外擦钙调磷酸酶抑制剂或糖皮质激素软膏等；但长期应用易产生药物依赖性[3]。中医学认为，本病病因病机多源于自身机体，由于禀赋尚不耐受，加之风、湿、热等多种邪气于体内相互搏结，阻于肌腠，发于体表所致。中医学运用独有的病证结合、四诊合参的诊疗模式，以较高的临床疗效及安全性，在改善症状、预防复发中展现出独特的优势。近年来，中医药外用治疗湿疹的方法日渐增多。

青蛇方为湖南中医药大学第二附属医院皮肤科自拟方，该方来源于《金匮要略·妇人杂病脉证并治》中的蛇床子散。湖南中医药大学第二附属医院研究团队在原方蛇床子的基础上，加以青黛、五倍子、白及，通过麻油浸渍萃取而成，故名“青蛇方”。四药相合，共奏清热解毒、消肿止痒之效。青蛇方在院内具有较长的使用时间，但其药物作用机制、作用靶点等尚不明确，需更进一步的研究探索。网络药理学通过构建药物成分-疾病靶点及信号通路图来预测药物治疗疾病的分子机制[4]。本研究采用网络药理学方法联合分子对接技术，深度剖析四味中药治疗湿疹的生物活性成分、核心靶点及通路作用机制，旨在为后续相关实验研究及其临床应用提供理论依据。

1、资料与方法

1.1 青蛇方药物活性成分及相关靶点的筛选

以青蛇方组方药物为关键字，即“青黛”“蛇床子”“五倍子”“白及”,运用TCMSP网络数据库平台筛选活性成分，设置类药性(DL)≥0.2作为生命体对外源性化合物吸收、分布、代谢和排泄(absorption, distribution, metabolism, andexcretion, ADME)性质的参数，以此来预测以上单味药的有效成分[5],获取关键化合物及作用靶点。将数据上传至UniProt网络数据库对其进行规范化注解。

1.2 湿疹靶点的挖掘与核心靶点的筛选

在DisGeNet、GeneCards网络数据库中，以“eczema”为关键词进行检索，获取相关靶点。将“1.1”项中的数据和疾病靶点上传至互联网在线Venny 2.1.0工具平台,获取共同靶点并绘制Venn图。

1.3 建立“中药-化学成分-共有靶点-湿疹”网络图

将“1.2”项中筛选所得的数据运用Cytoscape 3.9.1软件绘制网络图，并以度值(Degree)为筛选标准，筛选排前10位基因为核心基因；其中度值越大，则该节点在网络中越关键。

1.4 构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络

将“1.2”项中的数据上传至STRING网络数据库,将“homo sapiens”设定为物种属性，置信度设置为>0.7,得到所需PPI网络图。运用Cytoscape 3.9.1中的CytoNCA以及CytoHubba插件，进一步对PPI网络图进行分析。

1.5 基因本体(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

将PPI网络图中的蛋白导入DAVID网络数据库,进行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析；并利用微生信平台对挖掘数据进行可视化处理。

1.6 分子对接验证

为检验筛选出的潜在关键靶点精确性，利用PDB数据库下载结构数据，结合Autodock软件计算结合能，并通过PyMOL 2.5.4软件进行可视化。

2、结果

2.1 青蛇方活性成分

通过限定条件筛选，得到青蛇方有效化学成分63种(见表1),并筛选出相对应的生物活性靶点，再将所得靶点通过标准化注释、去重后，共获得青蛇方有效靶点99个。

表1 青蛇方主要活性成分

2.2 疾病靶点及绘制韦恩图

利用GeneCards和DisGeNet网络数据库挖掘以“eczema”为关键词的相关潜在靶点，合并去重后，得到1258个疾病相关靶点。并绘制青蛇方与湿疹交集靶点韦恩图(见图1),获得共同基因23个，即为青蛇方潜在作用靶点。

图1 交集靶点韦恩图

2.3 “中药-活性成分-共有靶点-湿疹”网络图

运用Cytoscape3.9.1软件，绘制网络图(见图2)。通过软件计算分析，Degree值排前5位的活性成分依次为：β-谷甾醇(MOL000358)、2,4,7-三羟基-9,10-二氢菲(MOL005757)、靛蓝素(MOL002309)、豆甾醇(MOL000449)、色氨酸(MOL001808)。

2.4 PPI网络图构建及核心靶点筛选

将“2.2”项中的数据上传至STRING网络数据库，创建青蛇方PPI网络图。利用Cytoscape3.9.1软件，剔除7个游离蛋白质靶点，创建共同靶点PPI网络图(见图3)。通过CytoHubba插件对网络图进行深度分析，获取青蛇方外用治疗湿疹Degree值排前10位靶点，分别为：转录因子AP-1(JUN)、肿瘤坏死因子(TNF)、原癌基因(RELA)、干扰素γ(IFNG)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、诱导型一氧化氮合酶(NOS2)、表皮生长因子受体(EGFR)、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)、趋化因子配体5(CCL-5)(见图4)。

图2 “中药-活性成分-共有靶点-湿疹”网络图

图3 核心靶点PPI网络图

图4 Degree值核心靶点(排前10位)

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析

GO功能富集分析显示，共得到256条分析结果，其中210条具有显著统计学意义(P<0.05),包括生物过程(BP)169条、细胞组分(CC)16条、分子功能(MF)25条，并将每种分析排前10位的结果以气泡图形式将其直观展出(见图5)。KEGG通路富集分析显示，获得96条富集结果，其中81条具有显著意义(P<0.05),并将KEGG富集通路排前10位的信号通路进行可视化展示(见图6)。

图5 GO功能富集分析

图6 KEGG通路富集分析

2.6 分子对接验证

以“2.3”项中的有效化合物为结合配体，“2.4”项中排前5位的核心靶点为对接受体，分别进行分子对接验证，共得出25组分子对接结合能结果(见表2)。一般认为，当结合能<0 kcal/mol时，表明化合物与靶点之间可以自行发生相互结合；当结合能<5.0 kcal/mol时，说明靶点与化合物之间具有较强的生物结合活性[6]。青蛇方中活性成分与各核心靶点之间的结合能力较好，其中与β-谷甾醇、2,4,7-三羟基-9,10-二氢菲、靛蓝素、豆甾醇、色氨酸对接最强的靶点均为RELA。并利用PyMol三维结构可视化软件将结合能相对较强的结合模式进行可视化(见图7)。

表2 分子对接结合能结果(kcal/mol)

图7 核心靶点对接可视化

3、讨论

湿疹引起的瘙痒以及其对皮肤的损伤性严重影响患者的生活质量，本研究采用网络药理学和分子对接相结合的方法，研究青蛇方外用治疗湿疹的潜在活性成分、靶点基因和作用机制，为中医药防治湿疹提供科学依据。

本研究通过对四味中药的化学成分分析，确定青蛇方外用治疗湿疹关键活性成分为β-谷甾醇、2,4,7-三羟基-9,10-二氢菲、靛蓝素、豆甾醇、色氨酸。分子对接结果显示这些成分可以与大多数核心靶点形成较好的对接模式。查阅文献发现，β-谷甾醇与豆甾醇属于常见的植物甾醇，β-谷甾醇具有调节细胞增殖与凋亡、促进血管新生、增强T细胞活性、抗氧化和维持细胞活性等作用，常被用于治疗各种炎症性疾病[7,8,9];β-谷甾醇与豆甾醇可以通过抑制白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等炎症相关细胞因子的活性，减少白细胞介素-1(IL-1)和TNF等炎症因子的分泌[10];实验表明，豆甾醇在抑制炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)、MCP-1表达上优于β-谷甾醇，提示豆甾醇抗炎效果优于β-谷甾醇[11]。相关实验表明，靛蓝素可下调体内IL-6水平，从而发挥其体外抗炎作用[12],同时亦有广谱抗菌作用，在体外对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌等均有明显抑制作用，还具有抗病毒和免疫调节作用[13]。因此，青蛇方中活性成分的抗炎与免疫调节功能可能在其治疗湿疹过程中发挥重要作用。

PPI网络分析得出，青蛇方外用治疗湿疹的核心靶点为JUN、TNF、RELA、IFNG、TGF-β1、NOS2、EGFR、PTGS2、PPARG、CCL-5等。研究发现，RELA归属核因子κB(NF-κB)信号通路家族成员之一，而RELA的磷酸化可以促进炎症反应[14]。进一步研究表明，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)具有较为广泛的生物学活性，可调节脂质代谢，介导炎症免疫反应，刺激自身及IL-1、IL-6、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)等炎性因子的生成与释放，从而发挥促炎作用，而TNF-α又对NF-κB有反馈调节作用，细胞因子在前炎性因子TNF-α等细胞因子正负反馈作用下不断上调，使细胞炎症反应持续存在[15]。PTGS2基因参与前列腺素生物合成途径，主要在炎症方面发挥作用；而EGFR为表皮生长因子受体，在炎症性皮肤病中，EGFR基因的缺少或丢失起着关键作用[16];此外EGFR还参与细胞稳态、增殖、分裂、分化和凋亡过程，其信号传导可能在湿疹的病理生理中起关键作用[17]。IFNG诱导的角质形成细胞活化而导致的细胞死亡将加重炎症反应[18],进而可能会加重湿疹症状。NOS2作为内源性介质可调节组织的修复和完整性，可能通过增加炎症细胞的凋亡、调节肥大细胞的活性来控制炎症[19],进而改善湿疹症状。

GO功能富集分析结果显示，青蛇方治疗湿疹主要涉及对外源性刺激的反应、基因表达的正向调控、RNA聚合酶II启动子转录的正向调节等；细胞质膜、细胞质、胞外区域等；蛋白质相互结合、同种蛋白相互结合、蛋白质同源二聚性等。KEGG富集分析结果表明，癌症信号通路可能是主要作用途径。湿疹的病理基础为慢性炎症，可累及至全身各处；持续的炎症反应过程可造成原癌基因活化和抑癌基因失活，为恶性肿瘤的形成提供理想环境。当大量氧化低密度脂蛋白(oxLDL)在血管内壁积聚时，会募集巨噬细胞对oxLDL进行吞噬，而吞噬了脂蛋白的巨噬细胞和受损的内皮细胞会合成并分泌大量TNF、IL-6、基质金属蛋白酶(MMPs)等促炎因子，从而促使免疫细胞浸润在局部形成的脂质池中，进一步促进炎症反应[20]。

综上所述，本研究借助网络药理学方法分析得出青蛇方有效成分可对炎症等相关生物学过程产生影响，并推测其可能是通过抑制癌症信号通路，产生抗炎作用，从而降低湿疹患者机体的炎症反应，促进免疫系统正常运行，进而改善皮损状态。本研究还可为后续进一步实验研究和临床应用提供相关参考。

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