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基于网络药理学探讨玉屏风散治疗过敏性紫癜的作用机制

2024-03-01 29 上传者：管理员

摘要：目的：基于网络药理学方法探讨玉屏风散治疗过敏性紫癜(HSP)的作用机制。方法：利用TCMSP、Pubchem、Swiss target prediction等数据库平台，对玉屏风散的有效活性成分和有效靶点基因进行检索、收集和筛选。通过Genecards、Disgenet、OMIM数据库查询和挖掘HSP的相关基因和玉屏风散治疗HSP的交集靶点，STRING数据库和Cytoscape 3.9.1软件构建活性-成分-靶点可视化网络和可视化分析。运用DAVID数据库进行基因本体(GO)功能及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。结果：筛选出45个玉屏风散活性成分，212个药物靶点，294个疾病靶点和35个交集靶点，对关键靶点进行蛋白质-蛋白质互作(PPI)网络构建，涉及的主要基因有肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-6、血管内皮生长因子A、白细胞介素-1β、肿瘤蛋白p53、基质金属蛋白酶-9、趋化因子c-c配体2、白细胞介素-10、丝氨酸蛋白酶抑制因子肽酶抑制因子、CXC趋化因子配体8等。GO功能富集分析得到条目数337个，其中生物过程条目284个，分子功能条目35个，细胞组成条目22个。KEGG通路富集分析得到信号通路101条，主要涉及高级糖基化终末产物-受体信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路、脂质和动脉硬化信号通路、疟疾信号通路、白细胞介素-17信号传导通路、TNF信号通路、核因子-κB信号通路等。结论：玉屏风散可能通过多成分、多靶点、多通路治疗HSP。

关键词：
HSP
作用机制
玉屏风散
网络药理学
过敏性紫癜
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过敏性紫瘢(henoch-schonlein purpura, HSP)属于全身性小血管炎综合征，多发于儿童及青少年，常累及胃肠道等脏器，难治愈且易复发，治疗周期较长，临床表现为皮肤紫癜、关节炎、腹痛、肾损害等[1,2]。HSP属于中医学“肌衄”“紫斑”“血证”“葡萄疫”等范畴，如《外科正宗·葡萄疫》记载：“葡萄疫，其患多生小儿，感受四时不正之气，郁于皮肤不散，结成大小青紫斑点，色若葡萄……久则虚人，斑渐方退”。研究发现，肾脏受累是本病的主要发病原因，若不及时治疗，可能会发展为肾病综合征甚至是终末期肾病[3]。目前，西医主要应用抗组织胺类药物(西咪替丁)、肾上皮质激素、免疫抑制剂等联合治疗[4,5]。大量激素药物治疗效果明显，但毒副作用较多，探寻本病的有效治疗药物和措施，对患者预后、减少复发风险等具有重要作用。

中医学对HSP发病机制、病因病机早有研究[6,7,8,9],并强调了本病正气不足、久病多虚的特点，中医药治疗HSP有独特的疗效。玉屏风散(由黄芪、白术、防风组成)在《丹溪心法》《医方类聚》等书中有记载，临床单独应用玉屏风散治疗HSP[10,11,12,13],或联合双嘧达莫[14]和西替利嗪[15]等治疗HSP,可减少激素和其他药物不良反应，缓解临床症状，减少治疗时间和降低炎性反应，并可增强体质和避免复发[16]。本研究基于成分-靶点-疾病探讨玉屏风散治疗HSP的作用机制，研究其潜在的物质基础、药物有效活性成分、靶点和通路等，为玉屏风散临床开发和药理实验提供理论基础。

1、资料与方法

1.1 玉屏风散活性成分的筛选

通过TCMSP等数据平台，检索防风、黄芪、白术所含化合物，检索条件设置为口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18。

1.2 玉屏风散活性成分相关靶点的收集和筛选

筛选玉屏风散活性成分，于TCMSP中检索，获取相关作用靶点，整理和剔除无靶点的化学成分。通过UniProt数据库将靶点名称校正为统一的基因名称。整理和分析玉屏风散活性成分和作用靶点基因名称，运用Cytoscape软件构建活性成分-靶点蛋白网络。

1.3 疾病相关靶点获取

以“Henoch-Schonlein purpura”为关键词，在DisGeNet、OMIM和GeneCards 数据库中进行检索，整理靶点数据和去除重复值，获得HSP相关靶点。

1.4 玉屏风散治疗HSP的靶点预测及蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建

检索得到的药物、化合物、靶点与疾病靶点导入Draw Venn Diagram数据库，相互映射匹配后得到药物与疾病的交集靶点作为玉屏风散治疗HSP的潜在靶点。整理和汇总靶点输入STRING数据库，构建PPI网络图，设置参数为物种“Homo sapiens”,可信度(combined score)>0.4进行筛选，获取tsv文件，建立和绘制核心靶点 PPI可视化网络图，并进行可视化分析。

1.5 基因本体(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

将获取的交集靶点导入DAVID数据库(阈值<0.05),代入玉屏风散治疗HSP的潜在靶点，并进行玉屏风散治疗HSP的GO功能和KEGG 通路功能富集分析。以上分析结束后，利用微生信平台研究和预测关键靶点涉及的生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)以及信号通路。

2、结果

2.1 玉屏风散活性成分与靶点筛选

根据条件筛选得到满足条件的玉屏风散活性成分共计45个：防风18个，黄芪21个，白术7个，重复活性成分1个(见表1)。运用DisGeNet、OMIM和GeneCards 数据库对玉屏风散活性成分治疗HSP进行靶点预测，剔除重复项，预测靶点有214个。同时，有5个活性成分无靶点而被删除，共39个玉屏风散活性成分进行靶点预测。

表1 玉屏风散治疗HSP主要活性成分

2.2 HSP疾病靶点的获取和潜在靶点预测

根据DisGeNet、OMIM和GeneCards数据库，检索和分析HSP靶点(去除重复靶点),共有294个靶点。将玉屏风散潜在作用靶点214个与HSP相关基因靶标294个利用韦恩数据库进行韦恩图的绘制(见图1),得到35个交集靶点，即为玉屏风散治疗HSP的关键靶点。

图1 交集靶点韦恩图

2.3 中药-活性成分-靶点网络构建

将214个潜在作用靶点、39个活性成分和玉屏风散组方的中药(黄芪、白术和防风)导入Cytoscape 3.9.1软件，构建网络图(见图2)。共有156个节点，707条边，“HQ”节点代表黄芪，“FF”节点代表防风，“BZ”节点代表白术，深紫色节点代表黄芪对应的化合物，浅紫色代表白术对应的化合物，绿色代表防风所对应的化合物，深红色菱形节点为黄芪和白术的共有成分，蓝色代表靶点，Degree值越大表明发挥着越重要的作用。同时，从化合物的角度分析，该网络平均Degree为17.6524,中介中心度(BC)平均值0.0125,紧密中心度(CC)平均值0.1326。其中，共有5个活性化合物成分高于 Degree、BC、CC 的平均值，核心成分依次为汉黄芩素、槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、联苯双酯，推测这5种活性成分为玉屏风散治疗HSP的主要活性物质(见表2)。

图2 药物-化合物-靶点网络图

表2 玉屏风散主要活性物质网络节点特征参数

2.4 PPI核心网络构建

从STRING平台获得交集靶点导入Cytoscape 3.9.1后，利用NetworkAnalyzer插件进行可视化分析，绘制玉屏风散-HSP关键靶点的PPI网络图(见图3),包括35个点375条边，并根据节点的度值筛出关键靶点。节点越大，Degree值越高和边(Edge)越粗，则该边连接的2个靶点紧密度越高，说明玉屏风散治疗HSP发挥的作用越大。玉屏风散治疗HSP的关键靶点基因包括：肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-6(IL-6)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤蛋白p53(TP53)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、趋化因子c-c配体2(CCL2)、白细胞介素-10(IL-10)、丝氨酸蛋白酶抑制因子肽酶抑制因子(SERPINE1)、白细胞介素-8(CXCL8)。

图3 PPI网络图

2.5 GO功能富集分析

对玉屏风散治疗HSP 的潜在靶点进行GO功能富集分析，得到GO富集条目337条。将35个关键靶点输入，共计得到相关条目 341条。其中，BP条目284条，主要涉及基因的转录与表达、炎症反应等；CC条目22条，主要涉及细胞外空间、细胞外区域、质体膜、膜、细胞表面等；MF条目35条，主要涉及蛋白结合、锌离子结合、相同的蛋白质结合、蛋白质的同质化活性、细胞因子活性、蛋白酶结合、蛋白质均二聚体活性等(见图4)。

图4 GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集分析

筛选出与HSP相关通路有101条，按P值由小到大排列，前20条KEGG通路如图5所示。从玉屏风散治疗HSP关键靶点KEGG通路分析图形看出，玉屏风散治疗HSP主要涉及核因子-κB(NF-κB)信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路、高级糖基化终末产物-受体(AGE-RAGE)信号通路、TNF信号通路等。

图5 KEGG通路富集分析

3、讨论

HSP可能与外邪侵入、免疫系统紊乱、感染等因素有关[17,18]。临床研究发现，HSP患者体内巨噬细胞的增加与其临床病理学表现的严重程度有关，巨噬细胞在HSP的急性和早期阶段发挥着重要作用[19,20]。同时，随着HSP(肾型)疾病时间延长，患者体内巨噬细胞内流倾下降，巨噬细胞浸润与肾小球损伤密切相关[21]。巨噬细胞被激活，吞噬作用增强，周围组织受损，从而加重了HSP[22]。

本研究表明，在HSP的294个疾病靶点中，玉屏风散主要活性物质为汉黄芩素、槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、联苯双酯。汉黄芩素可以减少M2型巨噬细胞对于TNF-α等细胞因子分泌[23],也可以调控TP53、IL-6、TNF-α、NF-кB 等mRNA表达[24]。槲皮素可以减轻巨噬细胞浸润和促炎性，降低急性肺损伤模型大鼠炎症[25]。玉屏风散的35个核心靶点经过101条信号通路对HSP进行治疗，主要有NF-κB信号通路、IL-17信号传导通路、AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路等。同时，玉屏风散促进巨噬细胞IL-1β、IL-8等细胞因子释放，且显示出浓度差异性[23]。研究显示，AGE-RAGE信号通路参与多种炎症过程，并刺激血管内相关生长因子，改变血管通透性，引起蛋白尿[26,27]。

玉屏风散扶正固表，具有提高机体抵御外邪和增强防御功能、免疫功能和抗病毒等特点，其中黄芪是补表之圣药，白术益脾，防风善于走表和祛风邪，三药合力，提高机体卫外防御能力。

本研究结果表明，玉屏风散治疗HSP可能与多成分、多靶点和通路有关，可通过改变促炎因子和抑炎因子的释放，减轻HSP患者的炎症反应，促进HSP患者机体恢复，达到扶正驱邪的功效。同时，结合巨噬细胞的增加与HSP(肾型)临床病理发现的严重程度有关，玉屏风散治疗HSP可能与炎症通路、调节免疫和巨噬细胞极化等有关，具体理论依据和现代药理机制需要进一步实验研究。

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