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金露梅不同药用部位6种黄酮类成分的含量比较

2024-09-21 107 上传者：管理员

摘要：目的建立同时测定金露梅叶、花、果和枝4个不同药用部位黄酮类成分儿茶素、槲皮素-3-O-（6''-没食子酰基）-β-D-半乳糖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、萹蓄苷和银锻苷含量的方法，并对不同部位含量结果进行比较。方法采用 Agilent Poroshell 120 PFP色谱柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，切换检测波长分别为280 nm和354 nm，柱温为30℃，流速为0.8 mL·min-1。采用柱状图及堆积柱状图表征不同药用部位6种化学成分的含量差异，Chiplot科研绘图平台对不同化学成分含量进行Spearman相关性分析。结果 6种化学成分的总含量在不同部位的分布为：花>叶>果>枝，Spearman相关性分析结果表明，金露梅中异槲皮苷和金丝桃苷、异槲皮苷和银锻苷、金丝桃苷和银锻苷的含量具有较强的正相关性，相关系数分别为0.98、0.93和0.93。结论该研究结果可为金露梅质量控制、临床应用和资源的合理开发利用提供依据。

关键词：
不同药用部位
含量比较
药王茶
金露梅
黄酮
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金露梅[Dasiphora fruticosa(L.)Rydb]为蔷薇科(Rosaceae)金露梅属(Dasiphora)落叶灌木植物[1]，又名金腊梅、金老梅、棍儿茶、药王茶等，生长于海拔1600～4000米的山坡草地、砾石坡、灌丛及林缘，在我国主要分布于青海、甘肃、四川、云南、西藏和黑龙江等地区。民间以金露梅嫩叶代茶叶饮用的历史悠久，据文献考证，青藏高原少数民族有金露梅叶片代茶饮的相关记载[2]。《全国中草药汇编》中记载其味甘，性凉，有清暑热、益脑清心、调经、健胃等多种作用。

金露梅化学成分丰富，主要含有黄酮类、酚酸类和鞣质类等化学成分[3-4]，现代药理学研究表明，金露梅具有降糖、降脂、抗心肌缺血、抗氧化、抗菌等多种药理功效[5-11]，其中降血糖效果尤为显著。目前有关金露梅的药用部位说法不一，《中国植物志》记载金露梅叶与果含鞣质，可提制栲胶，嫩叶可代茶叶饮用，花、叶药用[12]，另有文献报道，金露梅的药用部位为叶、花、根或全草[10]。中药化学成分是其发挥药效的物质基础，因此研究药材不同药用部位的化学物质基础及含量差异可以为其药用部位的合理应用提供科学依据[13]。近年来有关金露梅的栽培技术、制茶工艺、植化分离及药理作用均有较多研究[14-16]，尚无金露梅花、叶、果和枝各部位多种不同化学成分含量差异性和相关性的报道。

课题组前期基于高分辨质谱技术的金露梅化学成分研究表明，金露梅中含有大量的黄酮类成分，而黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抗肿瘤等广泛的生物活性和多种药理活性[17-20]，与金露梅的主要临床功效一致。本研究建立了同时测定金露梅不同药用部位中儿茶素、槲皮素-3-O-(6''-没食子酰基)-β-D-半乳糖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、萹蓄苷和银锻苷6种黄酮类成分的HPLC方法，并对其不同药用部位(花、叶、果、枝)中6种黄酮类成分的含量结果进行对比分析，以期为金露梅药材资源的合理开发和利用奠定科学基础。

1、材料

1260 InfinityⅡHPLC仪型高效液相色谱仪，配置DAD检测器及ChemStation色谱工作站(美国Agilent公司)；数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-400DE型)；SQP型十万分之一/万分之一电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)。

儿茶素对照品(批号：CHB210106，纯度：98%，成都克洛玛生物科技有限公司)；槲皮素-3-O-(6''-没食子酰基)-β-D-半乳糖苷对照品(批号：011247，纯度：98%，成都普思生物科技有限公司)；金丝桃苷对照品(批号：wkq20031109，纯度：98%，四川省维克奇生物科技有限公司)；异槲皮苷对照品(批号：151120，纯度：98%，上海圻明生物科技有限公司)；萹蓄苷对照品(批号：21010501，纯度：99.13%，成都普菲德生物科技有限公司)；银锻苷对照品(批号：HS20605B1，纯度：98%，宝鸡辰光生物科技有限公司)。乙腈为色谱纯试剂(美国Thermo Fisher Scientific公司)，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

金露梅野生资源样本经陕西省中医药研究院陈志永副研究员鉴定为蔷薇科金露梅属植物金露梅Dasiphora fruticosa(L.)Rydb的地上部分，样品信息见表1。样品标本存放于陕西省中医药研究院中药研究所。将3批金露梅药材的花、叶、果、枝按部位分拣、干燥并保存备用。

表1金露梅样品信息

2、方法与结果

2.1含量测定

2.1.1色谱条件

色谱柱为Agilent Poroshell 120 PFP(4.6 mm×150 mm，2.7μm)，流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱(0～20 min，5%～10%A；20～50 min，10%～18%A；50～60 min，18%～19%A；60～70 min，19%～30%A；70～80 min，30%～35%A)，检测波长为280 nm(0～26 min)和354 nm(26～80 min)，柱温30℃，流速0.8 mL·min-1，进样量10μL。

2.1.2对照品溶液的制备

称取各对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成含儿茶素1.07 mg·mL-1，槲皮素-3-O-(6''-没食子酰基)-β-D-半乳糖苷1.00 mg·mL-1，金丝桃苷0.92 mg·mL-1，异槲皮苷1.07 mg·mL-1，萹蓄苷0.96 mg·mL-1，银锻苷1.25 mg·mL-1的对照品储备液。精密量取各对照品储备液适量，加75%甲醇稀释制成含儿茶素535.0μg·mL-1，槲皮素-3-O-(6''-没食子酰基)-β-D-半乳糖苷100.0μg·mL-1，金丝桃苷184.0μg·mL-1，异槲皮苷42.8μg·mL-1，萹蓄苷48.0μg·mL-1，银锻苷62.5μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.3供试品溶液的制备

将金露梅药材的干燥叶、花、果和枝粉碎，过50目筛。精密称取金露梅样品粉末0.2 g，置100 mL具塞锥形瓶中，加入75%甲醇20 mL，超声45 min，放冷，用75%甲醇补足减失质量，摇匀，用微孔滤膜(0.22μm)滤过，取续滤液，即得。

2.1.4系统适用性试验

取混合对照品溶液和供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图见图1。结果显示6个待测成分色谱峰与其相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5，理论塔板数均不低于4000，拖尾因子在0.80～1.20，表明系统适用性良好。

图1金露梅混合对照品溶液(A)，样品溶液(B～E：S1-叶、S1-花、S1-果和S1-枝)的HPLC图

Fig 1 HPLC chromatograms of mixed reference solution(A)，and sample solution(B～E：S1-leaf，S1-flower，S1-fruit and S1-branch)

1.儿茶素(catechin)；2.槲皮素-3-O-(6''-没食子酰基)-β-D-半乳糖苷[quercetin-3-O-(6''-galloyl)-β-D-galactopyranoside]；3.金丝桃苷(hyperoside)；4.异槲皮苷(isoquercitrin)；5.萹蓄苷(avicularin)；6.银锻苷(tiliroside)

2.1.5线性关系考察

分别精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液0.1、0.2、1.0、2.0、5.0、10.0 mL置10 mL量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀，进样分析，记录色谱图，以待测成分质量浓度(μg·mL-1)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。取标准曲线最低浓度点对照品溶液逐级稀释，分别以信噪比(S/N)为3和10时的对照品浓度为检测限(LOD)和定量限(LOQ)。结果见表2。

2.1.6精密度试验

精密吸取同一混合对照品溶液10μL，重复进样6次，测定峰面积，计算得儿茶素、槲皮素-3-O-(6''-没食子酰基)-β-D-半乳糖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、萹蓄苷和银锻苷的峰面积RSD分别为0.22%、0.28%、0.14%、0.36%、0.39%和0.26%，表明仪器精密度良好。

2.1.7重复性试验

精密称取同一批样品粉末6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，进样分析，计算得儿茶素、槲皮素-3-O-(6''-没食子酰基)-β-D-半乳糖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、萹蓄苷和银锻苷的平均质量分数分别为30.4267、7.1671、6.3393、1.2763、4.2288和1.2746 mg·g-1，RSD分别为1.3%、1.7%、1.3%、1.4%、1.6%和2.1%，表明该方法重复性良好。

2.1.8稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于制备后室温放置0、2、4、8、12、24 h，在“2.1.1”项色谱条件下进样分析，计算得儿茶素、槲皮素-3-O-(6''-没食子酰基)-β-D-半乳糖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、萹蓄苷和银锻苷峰面积的RSD分别为0.25%、0.92%、0.67%、1.3%、0.61%和0.80%，表明供试品溶液在室温放置24 h内稳定。

2.1.9加样回收试验

取已知各成分含量的样品粉末约0.1 g，共称取6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，按加入量与样品相应成分含量为1∶1的比例分别加入各对照品适量，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，进样分析，计算各待测成分加样回收率，结果6种成分的平均加样回收率在96.48%～102.44%，RSD在1.5%～2.1%，表明方法准确性良好。

2.1.10样品含量测定

分别取金露梅不同部位(叶、花、果、枝)样品粉末各约0.2 g，精密称定，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，进样分析，计算6种待测成分的含量，结果见表3。

2.1.11金露梅不同药用部位化学成分含量差异性和相关性分析

本研究采用柱状图(见图2)及堆积柱状图(见图3)表征6种化学成分的含量差异，在定量限内未检测到的成分含量绘图时按0计算，由图2可知，儿茶素在所有药用部位中均含量最高，除了槲皮素-3-O-(6''-没食子酰基)-β-D-半乳糖苷外，其他5种成分在金露梅花中的平均含量均为最高。由图3可直观看，6种化学成分的总量在不同部位的分布为：花>叶>果>枝，其中金露梅枝的部位除儿茶素以外其他成分的含量均低到几近未检出。利用Chiplot科研绘图平台(https：//www.chiplot.online/)对金露梅中6种成分的含量进行Spearman相关性分析，结果见图4，其中异槲皮苷和金丝桃苷相关系数为0.98，异槲皮苷和银锻苷的相关系数为0.93，金丝桃苷和银锻苷的相关系数为0.93，儿茶素和槲皮素-3-O-(6''-没食子酰基)-β-D-半乳糖苷相关系数为0.89，萹蓄苷和金丝桃苷、银锻苷的相关系数分别0.84和0.80。相关系数越高，提示其在药材中的含量越具有较强的正相关性。

3、讨论

分别考察了不同色谱柱Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5μm)、Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5μm)和Agilent Poroshell 120 PFP(4.6 mm×150 mm，2.7μm)对色谱分离的影响，综合比较色谱峰数目、峰形和分离度和基线，发现相比于其他C18柱，采用PFP柱色谱图后半段能完全分离的色谱峰数目显著增多。最终选择了Agilent Poroshell 120 PFP(4.6 mm×150 mm，2.7μm)色谱柱。

分别考察了提取溶剂(30%、50%、75%、100%甲醇)、溶剂量(10、20、30 mL)以及超声提取时间(15、30、45、60 min)对待测成分提取率的影响，比较不同提取条件下色谱峰的峰面积及分离度，最终选择以75%甲醇为溶剂，溶剂量为20 mL，超声45 min进行提取。

《中国植物志》记载金露梅花、叶可供药用。本研究不同部位化学成分的含量测定结果表明，金露梅花除了槲皮素-3-O-(6''-没食子酰基)-β-D-半乳糖苷以外，儿茶素、金丝桃苷、异槲皮苷、萹蓄苷和银锻苷的平均含量均高于叶中含量，其中金丝桃苷和异槲皮苷在花中的含量为叶中的5倍，银锻苷在花中的含量为叶中的20倍。果中所有成分的平均含量均低于花，果中儿茶素、槲皮素-3-O-(6''-没食子酰基)-β-D-半乳糖苷和萹蓄苷的平均含量均低于叶，但金丝桃苷、异槲皮苷和银锻苷的平均含量却高于叶，且果部位银锻苷的平均含量约为叶的16倍。所测定的6个成分的总量为花>叶>果>枝，提示如以化学成分为评价指标，花和叶或者花、叶、果和枝同时作药用部位时，盛花期采集的药材质量应为最佳；如果各药用部位分开使用，花的品质应为最佳。而金露梅枝部位是否可与其他部位同作药用有待进一步研究确证。

本研究采用HPLC法测定金露梅不同药用部位儿茶素、槲皮素-3-O-(6''-没食子酰基)-β-D-半乳糖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、萹蓄苷和银锻苷6种黄酮类成分的含量，结果表明金露梅中黄酮类成分含量相对丰富。可考虑将以上6种黄酮类成分作为金露梅药材质量评价的标志物。

表26个待测成分的标准曲线、相关系数、线性范围、LOD和LOQ

表3金露梅不同部位中6种成分含量测定(n=3，mg·g-1)

图2金露梅不同部位6种化学成分含量柱状图(n=3)

图3金露梅不同部位6种化学成分含量柱状堆积图

图4金露梅不同部位6种化学成分含量的Spearman相关性分析

参考文献:

[1]中国科学院植物研究所.i Plant.cn植物智:中国植物+物种信息系统[DB/OL].[2022-07-21].http://www.iplant.cn/.

[2]王圭垚,刘玮,刘力宽,等.金露梅开发利用及保护研究进展[J].亚太传统医药,2023,19(8):240-243.

[3]许晓洁,王秋桐,石舵.金露梅的药理作用､化学成分及含量测定方法[J].中国药房,2017,28(22):3155-3156.

[5]王圭垚,刘玮,白美萍,等.基于斑马鱼模型探究金露梅绿茶水提物辅助改善血糖､血脂水平的功效[J].青海科技,2022,29(1):91-96.

[6]李成慧.金露梅降糖活性化合物分离制备的研究[D].青海:青海师范大学,2021.