萝卜硫素(sulforaphane, SFN)是一种广泛存在于十字花科植物中的天然异硫氰酸酯类化合物，具有明确的结构特征(分子式C6H11NOS2,分子量177.29)，常温下为黄色或无色油状液体，不溶于水，易溶于甲醇和二氯甲烷等有机溶剂(Mthembu et al., 2023)。西兰花种子和幼苗中SFN的前体物质葡萄糖萝卜硫素(glucoraphanin)含量较高，是其提取的理想来源。近年来，SFN作为功能性天然产物，其生物活性日益受到关注。现代药理学研究表明，SFN具有多种生物学作用，包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗菌、免疫调节以及心血管保护等(Zhang et al., 2023; Zuo et al., 2023)。SFN口服后吸收良好，生物利用度高，代谢快速(Otoo and Allen, 2023)，因此在预防和干预慢性疾病方面展现出广阔前景。

在心血管系统中，SFN的保护作用已被多项研究证实。例如，SFN可通过调控钙调素相关蛋白缓解缺血再灌注损伤(Zhang et al., 2022)，抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大(Wu et al., 2014)，调节线粒体-内质网联结稳定性(Silva-Palacios et al., 2023)，并通过抗氧化机制防止脂质过氧化引发的心肌损伤(Mthembuet al., 2025)。在动物实验中，SFN可有效降低异丙肾上腺素诱导的小鼠心脏标志物和氧化应激水平，从而改善心肌功能(Song et al., 2020)。

随着全民健身理念的普及，规律性运动已成为预防代谢性疾病的重要手段。然而，研究表明，运动强度与健康效益之间呈“J型曲线”关系，即中等强度运动有益，而超生理负荷运动可能诱发心肌损伤(Ogura and Shimosawa, 2014)。运动性心肌损伤(exercise-induced cardiac injury, EICI)是一类由力竭或高强度运动引发的心脏病理改变，表现为心肌结构紊乱、功能下降，甚至心律失常(Oláh et al., 2015)。其致病机制主要包括活性氧(ROS)过量产生、线粒体功能障碍、细胞凋亡和铁死亡等过程的激活(Loboda et al.,2016; Hu et al., 2021)。因此，调控氧化应激和程序性细胞死亡成为EICI干预的关键靶点。

Nrf2 (核因子E2相关因子2)是细胞氧化应激反应的核心调控因子，可诱导多种抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表达，从而维护内环境稳态(Loboda et al.,2016)。Keap1 (Kelch样ECH相关蛋白1)作为Nrf2的负调控蛋白，在常态下通过促进其蛋白酶体降解限制其活性(Itoh et al., 1999)。研究表明，高强度运动可抑制心肌Nrf2活性，而Nrf2通路的激活有助于缓解运动相关心肌损伤(Zhang et al., 2019)。SFN作为经典的Nrf2激动剂，已在多种研究中证实其通过激活Nrf2发挥心脏保护作用，包括减轻心肌缺血再灌注损伤(Silva-Palacios et al., 2019)、抑制AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡(Wang et al., 2022b)、增强内源性抗氧化系统(Song et al., 2020)等。

近年来，“铁死亡”(ferroptosis)作为一种依赖于铁离子和脂质过氧化的新型细胞程序性死亡方式，在心血管疾病中的作用受到关注。铁死亡的关键特征为细胞内Fe2+积聚、GSH耗竭与GPX4 (谷胱甘肽过氧化物酶4)功能丧失。Nrf2通过调控GSH合成和GPX4表达，在铁死亡调控中起负向调节作用(Dodson et al., 2019; Wang et al., 2022a)。据报道，SFN可通过Nrf2/IRF1/GPX4轴抑制铁死亡，改善心肌缺血及其他应激性损伤(Zheng et al., 2024)。然而，目前关于SFN是否可通过Nrf2介导铁死亡途径缓解EICI的研究仍属空白。为此，本研究以EICI模型大鼠为基础，系统探讨SFN对运动诱导性心肌损伤的干预作用及其机制。通过观察SFN对心功能参数、心肌损伤标志物、细胞凋亡、氧化应激水平及铁死亡核心指标的影响，并结合Western blot检测Nrf2/Keap1/GPX4通路蛋白变化，明确SFN在EICI中是否通过Nrf2信号通路抑制铁死亡，从而发挥心脏保护作用。研究结果有望为EICI防治提供新的药理基础和干预策略，同时丰富SFN在心血管疾病防治中的应用价值。

1、结果与分析

1.1萝卜硫素改善EICI大鼠的心功能

与正常对照组(C组)相比(表1)，EICI模型组大鼠的左心室射血分数(LVEF)显著降低(P<0.05)，而左心室舒张末期内径(LVIDd)和收缩末期内径(LVIDs)显著升高(P<0.05)，提示EICI显著损害心功能。经不同剂量萝卜硫素干预后(EICI+L/M/H-SFN组)，LVEF水平呈剂量依赖性回升，LVIDd与LVIDs逐渐下降，均与模型组相比具有显著差异(P<0.05)，其中高剂量SFN组改善最为明显。值得注意的是，联合Nrf2抑制剂ML385后(EICI+H-SFN+ML385组)，SFN对心功能的改善作用明显减弱，LVEF降低、LVIDd和LVIDs升高，较EICI+H-SFN组存在统计学差异(P<0.05)，提示SFN的心脏保护作用可能与Nrf2通路密切相关。

1.2萝卜硫素缓解EICI大鼠的心肌损伤

与对照组相比(表2)，EICI模型组大鼠血清中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)及心肌肌钙蛋白I(cTnI)水平均显著升高(P<0.05)，提示心肌细胞损伤明显。给予不同剂量萝卜硫素干预后，上述损伤指标均呈剂量依赖性下降，其中高剂量组(EICI+H-SFN)下降最为显著，LDH、CK及cTnI水平均较模型组明显降低(P<0.05)，表明SFN可有效减轻心肌损伤。值得注意的是，在联合Nrf2抑制剂ML385后(EICI+HSFN+ML385组)，LDH、CK及cTnI水平均再次升高，较EICI+H-SFN组差异有统计学意义(P<0.05)，提示SFN减轻心肌损伤的作用可能与Nrf2信号通路的激活密切相关。

表1萝卜硫素对EICI大鼠心功能参数的影响

表2萝卜硫素对EICI大鼠心肌损伤指标的影响

1.3萝卜硫素抑制EICI大鼠心肌细胞凋亡

结果显示，与对照组相比(图1;表3)，EICI模型组大鼠心肌组织TUNEL阳性细胞比例显著升高(P<0.05)，Bax mRNA表达明显上调，Bcl-2 mRNA表达下调(P<0.05)，提示EICI诱导了明显的心肌细胞凋亡。经SFN干预后，TUNEL阳性细胞明显减少，Bax表达逐渐下降，Bcl-2表达则逐渐升高，呈剂量依赖性变化，尤其在高剂量SFN组中改善效果最为显著(P<0.05)。然而，在联合Nrf2抑制剂ML385后，SFN的抗凋亡作用明显减弱，TUNEL+细胞比例及Bax表达水平再次升高，Bcl-2表达下降，均较EICI+H-SFN组存在显著差异(P<0.05)。结果表明，SFN对心肌细胞凋亡的抑制作用可能通过激活Nrf2信号通路实现。

1.4萝卜硫素改善EICI大鼠心肌氧化应激状态

结果显示(表4)，EICI模型组大鼠心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性显著下降(P<0.05)，丙二醛(MDA)水平显著升高(P<0.05)，表明氧化应激水平显著升高。SFN干预后，SOD和CAT活性呈剂量依赖性回升，MDA含量逐渐下降，且与模型组差异均具有统计学意义(P<0.05)，其中高剂量SFN组改善最为明显。联合Nrf2抑制剂ML385后(EICI+H-SFN+ML385组)，SOD与CAT活性再次下降，MDA水平升高，较EICI+H-SFN组存在显著差异(P<0.05)。这些结果提示，SFN可有效缓解EICI引起的心肌氧化应激反应，其机制可能与激活Nrf2抗氧化信号通路密切相关。

表3萝卜硫素对EICI大鼠心肌组织TUNEL+比例及Bax和Bcl-2转录的影响

表4萝卜硫素对EICI大鼠心肌组织氧化应激指标的影响

图1大鼠心肌TUNEL染色图像

1.5萝卜硫素调节EICI大鼠心肌铁死亡相关指标

结果显示(图2;表5)，EICI模型组大鼠心肌组织谷胱甘肽(GSH)水平显著降低，Fe2+含量明显升高(P<0.05)，同时GPX4蛋白表达显著下调，提示铁死亡过程显著激活。经SFN干预后，GSH水平逐渐回升，Fe2+含量下降，GPX4蛋白表达增强，表现出剂量依赖性改善趋势，尤以高剂量SFN组最为显著(P<0.05)。GPX4蛋白条带亦显示SFN可显著逆转其表达下调趋势(图2)。联合Nrf2抑制剂ML385后(EICI+H-SFN+ML385组)，GSH下降，Fe2+重新升高，GPX4表达显著下降，较EICI+H-SFN组差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明，SFN可能通过激活Nrf2/GPX4通路抑制EICI诱导的铁死亡过程，发挥心肌保护作用。

1.6萝卜硫素通过激活Nrf2/Keap1通路调节心肌抗氧化机制

与对照组相比(图3;表6)，EICI模型组大鼠心肌组织中Nrf2核转位显著减少(Nrf2/Lamin B1显著下降, P<0.05)，而Keap1蛋白表达显著升高(P<0.05)，表明Nrf2抗氧化信号通路被显著抑制。SFN干预后，Nrf2核表达水平逐渐升高，Keap1表达明显下调，呈剂量依赖性改善趋势，其中高剂量组效果最为显著(P<0.05)。联合Nrf2抑制剂ML385后，Nrf2核表达再次下降，Keap1水平上升，较EICI+H- SFN组存在显著差异(P<0.05)，提示抑制Nrf2可部分逆转SFN的调节作用。上述结果表明，SFN可能通过促进Nrf2核转位、抑制Keap1表达，激活抗氧化通路，从而发挥对EICI所致心肌损伤的保护作用。

表5萝卜硫素对EICI大鼠心肌GSH, Fe2+和GPX4蛋白含量的影响

图2各组大鼠心肌GPX4蛋白条带

图3各组大鼠心肌Nrf2 (细胞核)和Keap1蛋白条带

2、材料与方法

2.1萝卜硫素的提取与纯化

新鲜西兰花冷冻干燥后研磨，取10μg粉末加入PBS缓冲液(pH=7.0, 100 mL)和麦芽硫苷酶(Myrosinase, 1:50, w/w)，于37℃水浴中酶解2 h。反应液用乙酸乙酯(1∶1, v/v)萃取3次，合并有机相，硫酸钠干燥后旋蒸浓缩。粗提物经硅胶柱层析(乙酸乙酯∶正己烷=3∶1)除杂后，采用反相HPLC (C18柱,乙腈/水=40:60,流速1.0 mL/min, 254 nm)进一步纯化，收集目标峰组分。最终产物经真空干燥得浅黄色油状物。经HPLC测定，SFN纯度≥98%。

2.2实验动物

选用7~8周龄、体质量为250~300 g的SPF级雄性SD大鼠[生产许可证号: SCXK (苏) 2024-0001]，由苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司提供。实验动物饲养于屏障环境(温度24℃~26℃,湿度50%~60%,光照周期12 h/d)，自由摄食和饮水，适应性饲养7 d后开始实验。

2.3动物分组和处理

采用随机数字表法将大鼠随机分为以下6组(n=20/组)：对照组(C)：灌胃0.5%羧甲基纤维素钠溶液；运动性心肌损伤组(EICI)：灌胃0.5%羧甲基纤维素钠溶液；低剂量干预组(EICI+L-SFN)：灌胃20 mg·kg-·1 d-1萝卜硫素(SFN)溶液；中剂量干预组(EICI+M-SFN)：灌胃40 mg·kg-·1 d-1SFN溶液；高剂量干预组(EICI+H-SFN)：灌胃80 mg·kg-·1 d-1SFN溶液；拮抗剂联合组(EICI +H-SFN +ML385 )：灌胃80 mg·kg-·1 d-1 SFN溶液，同时腹腔注射30 mg·kg-·1 d-1ML385。所有干预制剂均以0.5%羧甲基纤维素钠为溶剂，连续给药4周。剂量设定参考既往药效学文献(Zhou et al., 2019; Khan et al., 2024)。

2.4运动性心肌损伤模型的建立

对照组大鼠在标准饲养环境下静息，其余各组自干预首日起接受持续4周的渐进式负重游泳训练以诱导运动性心肌损伤。训练采用圆柱形透明水槽(直径50 cm,水深50 cm)进行，水温恒定维持于(30±1)℃，使用恒温水循环系统。负重设置参考个体体质量，按5%比例定制铅块，通过医用级硅胶带固定于尾椎远端1/3处。训练前进行预适应性筛选，标准为无负重连续游泳≥30 min，以剔除低运动耐受个体。训练方案如下：每日两次(10:00, 16:00)，第1周为无负重适应性游泳(20~30 min/次)；第2周负重递增至2%；第3~4周维持5%负重，进行力竭性游泳训练。力竭标准为头部完全下沉且10 s内无法自主上浮，立即终止训练并进行干燥与保温。运动频次为每周5 d，持续4周，所有运动干预均安排在给药后2 h内进行。

2.5心脏功能评估

在末次干预后24 h，使用小动物专用超声成像系统(VisualSonics VEVO 3100)评估大鼠心脏功能，测量左心室射血分数(LVEF)、左室舒张末期内径(LVIDd)和左室收缩末期内径(LVIDs)。图像采集与数据分析严格遵循仪器操作手册进行。

2.6血清心肌损伤标志物分析

通过腹主动脉采集血液，4℃、3 000 r/min离心10 min后分离血清。采用分光光度法检测乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活性，心肌肌钙蛋白I (cTnI)浓度通过增强免疫比浊法定量分析。

2.7心肌细胞凋亡检测

实验动物在异氟醚麻醉下实施安乐死，完整摘取心脏组织，并置于4%多聚甲醛固定48 h。组织常规脱水、石蜡包埋后切片(厚度4μm)，根据TUNEL试剂盒说明书进行染色。阳性凋亡细胞通过激光共聚焦显微镜(Olympus BX63)观察并进行定量分析。

2.8心肌组织氧化应激指标及Fe2+检测

取新鲜心肌组织，按1:9 (w/v)比例与预冷匀浆液混合匀浆，4℃、12 000 r/min离心5 min后收集上清。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用WST-8法测定，过氧化氢酶(CAT)活性通过紫外分光光度法分析，丙二醛(MDA)含量用TBA法检测，还原型谷胱甘肽(GSH)水平采用微板法测定。亚铁离子(Fe2+)浓度采用微量法检测。

2.9 RT-qPCR使用TRIzol试剂

提取心肌组织总RNA，并通过NanoDrop 2000分光光度计检测A260/A280比值评估其纯度。利用QuantiTect逆转录试剂盒合成cDNA，采用UniPeak U+One Step RT-qPCR SYBR Green Mix结合ABI 7500 PCR系统进行扩增。扩增引物已列出(表7)，以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达量。

2.10 Western Blot

心肌组织分别采用核质分离试剂盒和RIPA裂解液提取核蛋白及总蛋白，并通过BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白样品，经10% SDS-PAGE分离后转印至PVDF膜。膜以5%脱脂奶粉封闭1.5 h，随后分别加入一抗(Nrf2, Keap1, GPX4, Lamin B1, GAPDH,稀释比例均为1:1 000)孵育过夜，再用HRP标记的二抗(1:1 000)孵育。采用ECL化学发光法显影，并使用Image Lab 4.1软件进行条带灰度分析。Lamin B1和GAPDH分别作为核蛋白和总蛋白的内参。

表7引物序列

2.11统计分析

所有实验数据以均值±标准差(Mean±SD)表示，采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(One-wayANOVA)，组间差异通过Tukey事后多重比较检验，P<0.05为差异具有统计学意义的判定标准。

3、讨论

萝卜硫素是一种广泛存在于西兰花、花椰菜等十字花科蔬菜中的天然异硫氰酸酯，其作为功能性植物化学物，在心脑血管、代谢类疾病防治中的活性作用已被广泛研究(Mthembu et al., 2023)。近年来，多项研究证实，SFN具有良好的心肌保护作用，可通过调节钙调素、抑制钙超载、维持线粒体稳定性等机制抵御缺血再灌注损伤(Song et al., 2020; Zhang et al.,2022)。本研究进一步验证，在EICI模型中SFN仍具有显著保护作用，提示其应用前景不仅限于缺血模型，还可拓展至运动性心肌损伤的预防与治疗。力竭运动作为一种极限生理应激状态，已被证实可通过线粒体功能障碍、氧化还原失衡、细胞凋亡和炎症反应等多种机制引发心肌损伤(Oláh et al.,2015)。本研究中，通过建立EICI模型大鼠发现，其心功能显著下降，心肌酶谱(LDH, CK, cTnI)水平显著升高，伴随心室重构指标(LVIDd, LVIDs)上升，提示心肌结构和功能均遭受破坏。值得注意的是，经萝卜硫素干预后，心功能参数显著改善，心肌酶下降，说明其可有效缓解力竭运动所致心肌损伤。

心肌细胞凋亡是EICI过程中的关键环节，TUNEL染色结果显示，力竭运动显著诱导心肌细胞凋亡，Bax表达升高、Bcl-2降低，提示线粒体通路活化。而SFN处理可有效逆转上述变化，显著降低TUNEL阳性细胞和Bax表达，提升Bcl-2水平，提高Bcl-2/Bax比值，表明其通过抑制线粒体通路介导的凋亡发挥保护效应。此前研究亦指出，SFN可通过调控PGC-1α、SIRT1等线粒体稳态相关通路保护心肌细胞(Fernandes et al., 2015; Chen et al., 2021)。结合本研究结果，SFN抑制EICI心肌凋亡的作用机制可能与其稳定线粒体功能密切相关。

氧化应激是EICI发生发展的核心病理过程，过量ROS生成可导致脂质过氧化、蛋白氧化及线粒体DNA损伤，从而破坏细胞功能(Ping et al., 2015)。本研究发现，SFN显著提升EICI大鼠心肌中SOD与CAT活性，降低脂质过氧化产物MDA含量，提示其可增强内源性抗氧化防御系统，从而缓解氧化损伤。这与Li等(2021)关于SFN通过溶酶体转录机制减轻ROS生成的发现一致。

铁死亡是一种新型细胞程序性死亡形式，其特征是Fe2+积聚、GPX4失活与脂质过氧化加剧。已有研究表明，力竭运动通过增强铁死亡信号通路进一步损伤心肌(Xiao et al., 2022; Tian and Li, 2024)。本研究中，EICI组大鼠GSH水平下降、Fe2+升高、GPX4表达显著下调，而SFN干预可恢复上述指标，表明其通过阻断铁死亡过程发挥保护作用。结合文献报道，SFN可通过Nrf2/GPX4轴维持红氧平衡(Ursini andMaiorino, 2020; Xue et al., 2023)，并调控下游铁代谢相关蛋白(如HO-1, FTH1)，增强对铁离子失衡的耐受性(Dang et al., 2022; Feng et al., 2023)。

Nrf2信号通路作为机体氧化应激应答核心调控系统，在EICI模型中表达受抑，Keap1上调，Nrf2核转位减少。SFN通过促进Nrf2核易位、下调Keap1，显著激活Nrf2/ARE下游抗氧化通路，这一机制与已有研究高度一致(Magesh et al., 2012; Pickering et al.,2012)。Nrf2还通过调控GPX4和GSH合成，间接抑制铁死亡通路的激活，形成氧化应激—铁死亡互作调控网络(Wang et al., 2022a; Zheng et al., 2024)。为进一步验证Nrf2的中介作用，本研究联合使用Nrf2抑制剂ML385，结果发现，ML385显著削弱了SFN对心功能、氧化应激及铁死亡的改善作用，进一步证实SFN通过激活Nrf2信号轴实现其心肌保护效应。此外，SFN作为蔬菜来源的天然化合物，其应用优势显著。首先，来源广泛、提取便捷，特别是西兰花种子富含前体葡萄糖萝卜硫素，是天然SFN的优质来源。其次，SFN具备较高的口服生物利用度(Otoo andAllen, 2023)，更适合开发为营养干预剂或功能食品。天然蔬菜提取物在慢性疾病管理中的多靶点、多机制调节优势，使其成为药物开发与公共健康干预的重要方向。

综上所述，本研究首次系统证实萝卜硫素通过激活Nrf2信号通路，抑制氧化应激与铁死亡，从而缓解EICI引发的心肌功能障碍、细胞凋亡及组织损伤，为SFN在运动相关心肌病中的应用提供了实验依据与理论基础。未来研究可进一步探讨SFN与其他天然营养因子的协同机制，以及其在运动营养干预中的实际效果。

文章来源:任绍涛.萝卜硫素预处理减轻力竭运动诱导心肌损伤的机制研究[J].分子植物育种,2025,23(13):4514-4522.