首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 药学论文 > 药物分析论文 > HPLC法测定蝉蜕不同煎煮时间下4种成分含量变化

HPLC法测定蝉蜕不同煎煮时间下4种成分含量变化

2025-05-23 131 上传者：管理员

摘要：目的建立高效液相色谱法测定蝉蜕水煎液中4种成分的含量，探究不同煎煮时间下蝉蜕水煎液中4种成分的含量变化。方法采用CORTECSUPLCT3（2.1mm×150mm，1.6μm）色谱柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相进行梯度洗脱，流速0.3mL•min-1，检测波长280nm，柱温35℃，进样量2μL。结果4种化学成分在各自范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系（R2≥0.9998），平均加样回收率在96.42%～104.01%；精密度、稳定性、重复性、中间精密度试验的RSD均小于5%，且具有良好的耐用性。随着煎煮时间的延长，原儿茶酸、原儿茶醛、乙酰多巴胺的含量增加；乙酰多巴胺二聚体的含量呈现出先增后降的趋势。结论建立的方法稳定可靠，不同煎煮时间下蝉蜕4种成分含量发生变化，可为蝉蜕的临床应用及含蝉蜕经典名方复方制剂研究提供参考。

关键词：
乙酰多巴胺二聚体
原儿茶酸
原儿茶醛
煎煮时间
蝉蜕
加入收藏

蝉蜕为蝉科昆虫黑蚱（CryptotympanapustulataFabricius）的若虫羽化时脱落的皮壳，性寒，味甘，归肺、肝经，具有疏散风热、利咽、透疹、明目退翳、解痉等功效[1]。现代研究表明，蝉蜕的活性成分主要有乙酰多巴胺聚体和酚类、甲壳质、氨基酸等[2]，具有抗惊厥、解热镇痛、止咳平喘、抗炎、抗氧化等作用。蝉蜕常用于风热感冒，咽痛，音哑，麻疹不透，风疹瘙痒，目赤翳障，惊风抽搐，破伤风等的治疗。　　蝉蜕在古代多用于温热病、儿科、眼科、皮肤科等一切风热之证，在诸多方剂中多有应用，如宋代《博济方》的“蝉蜕散”，《太平惠民和剂局方》的“蝉花散”“乌犀圆”“反魂丹”“大通真圆”，明代《普济方》的“蝉朱散”“蝉砂丸”等。2020年版《中国药典》收载含蝉蜕的成方制剂更是多达31首，如儿科用药小儿至宝丸、眼科用药拨云退翳丸、皮肤科用药金蝉止痒胶囊、喉科用药金果饮等[3]。历版《中国药典》及临床应用中蝉蜕均为水煎入药[4]，而中药的作用机制复杂，可能是多成分协同作用发挥药效，在煎煮过程中会发生复杂的化学反应，显著影响中药的安全性、有效性及质量可控性[5-6]，因此阐明蝉蜕煎煮过程的质量变化尤为重要。目前对蝉蜕的研究主要集中在真伪鉴别、临床应用和作用机制等方面，对于蝉蜕的质量标准尚有欠缺，2020年版《中国药典》只对其性状进行了规定，缺乏其他定量指标。因此本试验采用高效液相色谱法，建立同时测定蝉蜕中4种主要活性成分原儿茶酸、原儿茶醛、乙酰多巴胺、乙酰多巴胺二聚体含量的方法，并测定不同煎煮时间蝉蜕水煎液中4种成分的含量变化，以期为蝉蜕质量评价及临床应用提供参考。

1、材料

1.1　仪器　　

Acquity-H-Class超高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；MS105电子天平（上海梅特勒·托利多有限公司，十万分之一）；BT457A10电子天平（深圳市博途电子科技有限公司，精度：0.01g）；DZKW-4电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器有限公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2　试药　　

乙腈（色谱纯，默克股份两合公司）；磷酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为实验室自制超纯水。乙酰多巴胺对照品（批号：M17HT1850573，上海源叶生物科技有限公司，纯度≥97%），乙酰多巴胺二聚体对照品（批号：RS231129，成都普恩生物科技股份有限公司，纯度≥98%），原儿茶酸对照品（批号：110809-202207，纯度：97.5%）、原儿茶醛对照品（批号：110810-202210，纯度：99.9%）（中国食品药品检定研究院）；蝉蜕饮片8批，经河南中医药大学陈随清教授鉴定为蝉科昆虫黑蚱（CryptotympanapustulataFabricius）的若虫羽化时脱落的皮壳，均符合2020年版《中国药典》要求，信息见表1。

表1　蝉蜕样品信息

2、方法与结果

2.1　色谱条件　　

色谱柱为CORTECSUPLCT3（2.1mm×150mm，1.6μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）；洗脱梯度（0～5min，6%A；5～25min，6%～25%A；25～26min，25%～6%A；26～32min，6%A）；检测波长280nm；柱温30℃；流速0.3mL·min－1；进样量2μL。

2.2　溶液制备

2.2.1　不同煎煮时间蝉蜕水煎液供试品溶液　

称取45g蝉蜕饮片于砂锅中，加20倍水浸泡30min，武火加热至沸腾，文火保持微沸，煎煮0～180min，每隔20min取样2mL用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.2　对照品溶液的制备　

分别称取各对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1mL含原儿茶酸10.6μg、原儿茶醛10.0μg、乙酰多巴胺61.2μg和乙酰多巴胺二聚体56.6μg的混合对照品溶液。

2.3　方法学考察

2.3.1　专属性考察　

精密吸取“2.2”项下供试品溶液、混合对照品溶液、空白溶剂（水），按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果见图1。各成分分离度良好，空白溶液无干扰，表明方法专属性良好。

2.3.2　线性关系考察　

分别取各对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1mL含原儿茶酸105.7μg、原儿茶醛100.5μg、乙酰多巴胺414.4μg和乙酰多巴胺二聚体296.5μg的混合对照品储备液。精密吸取混合对照品储备液，分别稀释成浓度为混合对照品储备液1%、2%、5%、10%、20%、50%、100%的原儿茶酸、原儿茶醛、乙酰多巴胺、乙酰多巴胺二聚体对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析。以指标成分峰面积（Y）对对照品溶液浓度（X）作标准曲线，得回归方程，结果见表2。

2.3.3　精密度试验　

取“2.2.2”项下混合对照品溶液，重复进样6针，记录峰面积，计算得原儿茶酸、原儿茶醛、乙酰多巴胺、乙酰多巴胺二聚体峰面积的RSD值分别为1.2%、1.4%、1.8%、2.0%，表明仪器精密度良好。

2.3.4　稳定性试验　

取编号为XX1的蝉蜕饮片适量，采用“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、16、20h分别进样，记录峰面积，计算得原儿茶酸、原儿茶醛、乙酰多巴胺、乙酰多巴胺二聚体4种成分的含量的RSD分别4.5%、3.6%、1.8%、1.7%。结果表明蝉蜕水煎液供试品溶液在20h内稳定性良好。

图1　混合对照品（A）、蝉蜕水煎液（B）及空白溶剂（水）（C）HPLC图谱

表2　线性关系考察结果

2.3.5　重复性试验　

取编号为XX1的蝉蜕饮片适量，按照“2.2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，进样测定，记录峰面积，计算得原儿茶酸、原儿茶醛、乙酰多巴胺、乙酰多巴胺二聚体的含量的RSD分别为1.3%、1.8%、2.9%、1.2%，表明方法重复性良好。

2.3.6　加样回收试验　

按照“2.2.1”项下方法制备一份供试品溶液，精密移取9份，每份10mL，置20mL量瓶中，分别精密加入供试品溶液中对应成分50%、100%、150%量的对照品溶液各3份，加水定容至刻度，进样测定，计算加样回收率。结果显示，原儿茶酸、原儿茶醛、乙酰多巴胺、乙酰多巴胺二聚体对照品加入量为50%、100%、150%的回收率分别为101.63%、97.16%、98.78%，96.93%、98.51%、100.35%，96.78%、99.83%、98.54%，104.01%、102.35%、96.42%，RSD值均小于4%，表明该方法回收率良好。

2.4　蝉蜕水煎液4种成分含量测定　　

取蝉蜕饮片适量，按照“2.2.1”项下方法，平行制备３份，进样测定，记录峰面积，按外标法计算8批样品煎煮过程蝉蜕水煎液4种成分含量，结果见图2。

图2　煎煮过程蝉蜕中4种成分含量的变化

3、讨论

3.1　耐用性考察　　

试验前期考察了不同流速（0.25、0.30、0.35mL·min－1），不同柱温（32、35、38℃），不同浓度磷酸（0.09%、0.10%、0.11%）及不同色谱柱情况下的耐用性，结果4种成分含量的RSD值均小于2%，说明该方法耐用性较好。

3.2　检测成分的选择　　

研究发现蝉蜕水煎液具有止咳、降低血液黏稠度、降低三酰甘油及总胆固醇水平、改善妊娠晚期大鼠子宫运动节律、上调子宫组织PGE2及COX-2表达水平等作用[7-10]。其中蝉蜕水煎液含有的乙酰多巴胺单体、二聚体具有较强的抗炎和抗氧化等生物活性[11-12]，可能是蝉蜕抗惊厥、平喘、抗炎、抗变态反应和改善血液流变学等药理作用的主要活性成分[13]，研究还发现乙酰多巴胺单体具有免疫调节、抗肿瘤、改善睡眠等作用[14-16]。原儿茶酸和原儿茶醛除了具有抗炎、抗氧化、抗菌等作用外[17-18]，原儿茶醛还有抗动脉粥样硬化、抗血栓形成、保护心肌细胞等功效[19]，原儿茶酸还具有抗衰老等药理活性[20]。故检测以上4种成分，综合评价煎煮时间对蝉蜕药效的影响。

3.3　煎煮时间考察　　

蝉蜕应用广泛，在很多传统方剂中都有应用，然而大部分方剂只笼统记载采用水煎服，并未阐明具体的煎煮时间。2020年版《中国药典》中蝉蜕相关的成方制剂的煎煮时间各不相同，煎煮时间最长的3h，最短的仅0.5h。清代名医徐灵胎曾说：“煎药之法，最宜深讲，药之效不效，全在乎此。......方虽中病，而煎法失度，药必无效”[6]。煎煮时间对于中药质量、疗效有着重要的影响。若煎煮时间不够，中药的有效成分不能完全溶出；若煎煮时间过长，药液中的有效成分易受热分解或挥发，因此选择合适的煎煮时间对于蝉蜕的临床应用有重要的意义。本研究结果显示，随着煎煮时间的延长，原儿茶酸、原儿茶醛的含量逐渐增加，原因可能为这两种成分水溶性较好，随着煎煮时间延长不断溶出；乙酰多巴胺的含量逐渐增加，在120min时趋向平稳，含量不再明显增加；乙酰多巴胺二聚体的含量随煎煮时间的增加显示出先增后降的趋势，拐点在80～100min附近，在180min时含量与煎煮20min时基本持平。在煎煮过程中，原儿茶酸、原儿茶醛虽然含量一直增加，但增加幅度不大。因此从蝉蜕4种有效成分含量出发考虑蝉蜕最佳的煎煮时间应为80～100min。

参考文献:

[1]中国药典2020年版.一部[S].2020:385-386.

[2]李洁,邵蒙苏,王盈蕴,等.蝉蜕的临床应用及其用量探究[J].长春中医药大学学报,2021,37(3):508-511.

[3]冯林敏,杨树谊,潘激扬,等.经典名方中蝉蜕的本草考证[J/OL].中国实验方剂学杂志,doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20250269.

[4]李涛.蝉蜕质量标准提升研究[D].成都:成都中医药大学,2018.

[5]赖长江生,陈泽炎,邱子栋,等.中药煎煮的化学反应机制研究现状[J].中国中药杂志,2023,48(4):890-899.

[6]龙小妹,张艳娇,黄宽,等.HPLC法测定不同煎煮时间疏调气机汤中芍药苷和淫羊藿苷的含量[J].云南中医中药杂志,2022,43(4):60-64.

[7]江泓,杨炀,陈胡兰,等.蝉蜕止咳祛痰平喘有效部位筛选[J].中国现代中药,2017,19(1):56-59.

[8]刘善庭,李建美,王立赞,等.蝉蜕对大鼠血液流变学影响的试验研究[J].中医药学报,2004,30(3):56-58,84.

[9]安磊.蝉蜕的抗惊厥作用[J].中国医药导报,2008,5(15):35-36.

[10]王锋,徐静,童婷婷,等.蝉蜕水煎剂对妊娠晚期大鼠子宫运动节律及PGE2､COX-2水平的影响[J].中医药信息,2021,38(11):27-32.

基金资助:道地宛药全产业链关键技术研发及应用(No.221100310400);