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表没食子儿茶素没食子酸酯抑制鲍曼不动杆菌ABK450生物被膜形成

2025-07-13 51 上传者：管理员

摘要：目的探究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对鲍曼不动杆菌ABK450生物被膜形成的作用。方法建立ABK450成熟生物被膜模型，加入蛋白酶K、脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)、高碘酸钠处理成熟生物被膜，并测定其生物被膜的残留量。微量肉汤稀释法测定EGCG对ABK450的最低抑菌质量浓度(MIC)。不同质量浓度EGCG处理ABK450后，采用结晶紫染色法测定其生物被膜的形成量，MTT法检测生物被膜细胞相对活性，显微镜成像技术观察生物被膜结构；分别运用Bradford法、苯酚-硫酸法和微量分光光度法测定其生物被膜胞外蛋白、胞外多糖和胞外DNA(eDNA)含量。结果ABK450静置培养48h可形成成熟生物被膜，其生物被膜胞外聚合物中含有大量多糖和蛋白质以及少量eDNA。EGCG对ABK450的MIC为512mg/L。与0mg/L比较，32mg/LEGCG开始抑制ABK450生物被膜的形成，64mg/LEGCG开始抑制生物被膜细胞活力，同时对生物被膜结构破坏效果显著，使形成的生物被膜结构更为松散，并且抑制效果随着EGCG质量浓度的增加而增强。与0mg/L比较，32mg/LEGCG明显抑制了生物被膜蛋白质和多糖的合成，但对eDNA的分泌并无影响。结论EGCG可以有效抑制ABK450生物被膜的形成。

关键词：
ABK450
医院感染
生物被膜
表没食子儿茶素没食子酸酯
鲍曼不动杆菌
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鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii,AB)是医院感染的主要病原体,其耐药性强,重症医学病房患者感染后的死亡率达30%~75%[1-2]。研究表明,生物被膜可使细菌对抗生素耐受性增强100~1000倍[3-4],且65%以上的院内感染与其相关,易引发肺炎等致命疾病[5-7],因此,抑制生物被膜的形成对于控制感染至关重要。

研究表明,天然成分表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate,EGCG)具有抗菌[8]、抗氧化[9]、抗炎[10]、抗癌[11]、抗病毒[12]等功效,对金黄色葡萄球菌[13]、大肠杆菌[14]、铜绿假单胞菌[15]等病原体的生物被膜有抑制作用。本文以临床多重耐药AB菌株为研究对象,探究EGCG对其生物被膜形成的作用,为临床治疗提供理论依据。

1、材料和方法

1.1菌株来源鲍曼不动杆菌

ABK450为课题组前期从南华大学附属第一医院1名脑动脉瘤破裂出血的临床病人的痰液标本中分离的菌株,根据牛津方案鉴定其多位点序列分型为ST208型,属于全球流行最广的GC2克隆群[16]。

1.2主要试剂与仪器

LB肉汤培养基购自上海生工生物工程股份有限公司;MH肉汤培养基购自青岛海博生物科技有限公司;EGCG购自上海麦克林生化科技有限公司;MTT购自北京酷莱博生物科技有限公司;蛋白酶K溶液购自北京索莱宝生物科技有限公司;脱氧核糖核酸酶I(deoxyribonucleaseI,DNaseI)购自北京雷根生物技术有限公司;生物安全柜(HR1500-IIA2型)购自青岛海尔生物医疗股份有限公司;酶标仪购自美国Bio-RAD公司。

1.3结晶紫染色法测定生物被膜成熟时间

将对数生长期的ABK450菌液稀释至1×106CFU/mL,取200μL接种于96孔板中,37℃培养72h,每隔24h更换新鲜培养基。分别在0、6、12、18、24、30、36、48、72h取出96孔板,弃去培养基,无菌PBS洗涤3次,56℃干燥1h,0.1%结晶紫染色30min,无菌PBS洗涤3次,吹干后,加入33%冰乙酸脱色10min,采用酶标仪测定各孔570nm处光密度(opticaldensity,OD)值,判断生物被膜成熟时间。每个时间点设置6个平行组。

1.4ABK450生物被膜胞外聚合物成分的测定

为初步确定ABK450胞外聚合物(extracellularpolymericsubstances,EPS)成分中蛋白质、胞外DNA(extracellularDNA,eDNA)和多糖在生物被膜中的占比情况,实验采用蛋白酶K、DNaseI酶和高碘酸钠处理成熟生物被膜。取2mL1×106CFU/mL的菌液于6孔板中,37℃培养48h,建立成熟生物被膜。弃去培养基,无菌PBS洗涤3次,吹干后,分成4组,分别加入2mL0.1g/L蛋白酶K(蛋白酶K组)、0.1g/LDNaseI(DNaseI酶组)、10μmol/L高碘酸钠(高碘酸钠组)、无菌PBS(阳性对照组),每组设置3个复孔,37℃孵育3h。按照1.3方法进行结晶紫染色,测定各孔OD570值,并以阳性对照组生物被膜量为100%,按照公式(处理组生物被膜残留量=处理组OD570值/阳性对照组OD570值×100%)计算各组EPS中蛋白质、eDNA和多糖在成熟生物被膜中的占比情况。

1.5EGCG最低抑菌质量浓度测定

用MH肉汤将EGCG溶液进行二倍系列稀释,加入96孔板中(100μL/孔)。取100μL1×106CFU/mL的菌液加入各孔中,混匀,使得每孔药液终质量浓度为1024、512、256、128、64、32、16、0mg/L,以不含菌但含有相同终质量浓度EGCG的培养基为药物空白对照,以无菌培养基为阴性对照组,每组设置3个平行组。37℃培养24h。测定各孔OD600值,计算药物组与药物空白对照组光密度差值(ΔOD600),当EGCG处理孔的ΔOD600小于阴性对照组时,视为无菌生长,此时的最低药物质量浓度为最低抑菌质量浓度(minimuminhibitoryconcentration,MIC)[17]。

1.6EGCG对ABK450生物被膜形成的抑制实验

取100μL1×106CFU/mL的菌液放入含有100μL不同质量浓度EGCG溶液的96孔板中,使药物终质量浓度为256、128、64、32、16、0mg/L,每组设置6个平行孔,以0mg/LEGCG组为对照组。37℃培养48h。按照1.3方法进行结晶紫染色,测定各孔OD570值,以对照组的生物被膜形成量为100%,按照1.4中公式计算生物被膜形成量。

1.7MTT法测定生物被膜细胞相对活性

按照1.6培养并处理ABK450的生物被膜,无菌PBS洗涤3次,干燥后,每孔加入200μL0.5g/L的MTT溶液,37℃避光孵育4h,弃去孔内溶液,无菌PBS洗涤2次,吹干,加入DMSO溶液,采用酶标仪测定各孔OD490值,以0mg/LEGCG组为对照组,以对照组的生物被膜细胞相对活性为100%,按照公式[生物被膜细胞相对活性(%)=处理组OD490值/对照组OD490值×100%]计算各组生物被膜细胞相对活性。

1.8生物被膜形态结构观察

按照1.6准备ABK450菌液,设置对照组和不同质量浓度EGCG组。在24孔板中每孔加入1mL菌液,EGCG组加入1mLEGCG溶液,使药物终质量浓度为256、128、64、32、16mg/L,对照组加入1mLLB培养基。37℃静置培养48h。按照1.3方法进行结晶紫染色并干燥后,直接于倒置荧光显微镜下观察生物被膜形态结构。

1.9EGCG处理鲍曼不动杆菌ABK450后EPS成分含量的测定

参照文献[18]的方法。取1mL1×106CFU/mL的菌液与1mLEGCG溶液混匀,加入6孔板中,使药物终质量浓度为0、16、32mg/L,37℃培养48h。弃去培养基,无菌水清洗3遍,加入2mL2%NaCl2%EDTA溶液,37℃,160r/min振荡孵育4h,4℃,4000r/min离心10min,取上清,即为EPS提取液。分别取不同质量浓度菌液1mL,用苯酚-硫酸法测定多糖水平,Bradford法测定胞外蛋白水平。另外取1mL用苯酚-氯仿法提取eDNA,微量分光光度计测定eDNA水平。

1.10统计分析

采用Prism9.5对数据进行分析。两组间比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1ABK450生物被膜成熟时间及其EPS成分

随着培养时间的延长,ABK450生物被膜形成量逐渐增多,当培养48h时,生物被膜总量最多,且不随培养时间的延长而增加,表明此时生物被膜已成熟(图1A)。故本研究选择48h作为后续实验的生物被膜培养时间。与阳性对照组相比,高碘酸钠组、蛋白酶K组和DNaseI酶组的生物被膜减少(P<0.05),其中高碘酸钠组生物被膜减少的最多,其次是蛋白酶K组、DNaseI酶组。提示ABK450生物被膜EPS中包含大量多糖和蛋白质以及少量eDNA(图1B)。

图1ABK450生物被膜的形成及其EPS成分鉴定

2.2EGCG对ABK450最低抑菌质量浓度结果

阴性对照组OD600为0.052,EGCG质量浓度为512mg/L时,ΔOD600为0.016,且小于0.052,所以EGCG对ABK450的MIC为512mg/L(图2)。

图2EGCG对ABK450的MIC测定

2.3EGCG对ABK450生物被膜形成的影响

与0mg/LEGCG组相比,32、64、128、256mg/LEGCG与ABK450共培养48h后,生物被膜形成量显著减少(P<0.05;表1),生物被膜明显被破坏,形成的生物被膜结构也更加松散(图3);64、128、256mg/LEGCG与ABK450共培养48h后,生物被膜细胞相对活性明显降低(P<0.05;图3、表1)。提示EGCG对ABK450生物被膜形成具有明显的抑制作用。

图3EGCG对ABK450生物被膜形成的影响

表1不同质量浓度EGCG对ABK450生物被膜形成量及生物被膜细胞相对活性的影响

2.4不同质量浓度EGCG对ABK450EPS蛋白质、多糖和eDNA含量的影响

与0mg/LEGCG组比较,16mg/LEGCG处理组形成的EPS中蛋白质、多糖没有明显变化;32mg/LEGCG处理组形成的生物被膜中蛋白质和多糖含量显著减少(P<0.05);不同质量浓度的EGCG对生物被膜中eDNA的含量没有明显影响(P>0.05;表2)。

表2不同质量浓度EGCG对ABK450EPS蛋白质、多糖和eDNA含量的影响

3、讨论

目前,鲍曼不动杆菌对常用的抗生素耐药率均在50%以上,特别是对碳青霉烯类药物的耐药,常规抗生素治疗已无法有效控制感染[19]。因此亟须找到新的治疗手段或新的药物来应对鲍曼不动杆菌日益严峻的抗生素耐药问题。研究发现,多数耐药鲍曼不动杆菌具有较强的生物被膜形成能力,菌株的耐药性和生物被膜形成之间存在互相促进的正向关系[20];提示抑制或清除生物被膜能够减轻抗生素耐药负担。

3讨论目前,鲍曼不动杆菌对常用的抗生素耐药率均在50%以上,特别是对碳青霉烯类药物的耐药,常规抗生素治疗已无法有效控制感染[19]。因此亟须找到新的治疗手段或新的药物来应对鲍曼不动杆菌日益严峻的抗生素耐药问题。研究发现,多数耐药鲍曼不动杆菌具有较强的生物被膜形成能力,菌株的耐药性和生物被膜形成之间存在互相促进的正向关系[20];提示抑制或清除生物被膜能够减轻抗生素耐药负担。

EPS是生物被膜的重要组成部分,主要由蛋白质、多糖和eDNA构成,不同细菌生物被膜的EPS成分可能不同。蛋白酶K、DNaseI酶可以降解蛋白质和eDNA,高碘酸钠可以氧化多糖分子中的邻羟基基团处的C-C键,降解多糖,破坏生物被膜。实验结果显示,ABK450生物被膜EPS中包含大量的多糖和蛋白质以及少量的eDNA。32mg/LEGCG可使胞外蛋白质和多糖的形成量显著减少,但不影响eDNA的产生,表明EGCG抑制ABK450生物被膜的形成可能主要是通过抑制生物被膜EPS中蛋白质和多糖的形成而发挥作用。在其他病原体研究中也有类似发现,如Aragão等[13]发现,EGCG通过影响多糖的合成抑制变形链球菌生物被膜的形成;Franco等[24]发现,EGCG可以抑制淀粉样蛋白产生,抑制溶血性链球菌生物被膜形成。

虽然,EGCG在抗菌、抗生物被膜等方面具有良好的作用,但是,其易受光照、温度、pH以及生物体内酶等的影响,稳定性较差,约90%的EGCG可以随尿液和粪便排出,在人体内的生物利用率较低,导致其临床应用受限[25]。目前,主要通过结构修饰或构建纳米载体、脂质体等提高EGCG的稳定性及生物利用率,以期望其能够在临床治疗中得到广泛应用。

综上所述,EGCG通过抑制胞外多糖和蛋白质的合成,破坏生物被膜的结构,从而抑制ABK450生物被膜的形成,是一种具有潜力的抗生物被膜制剂。未来的研究应进一步探索其在体内环境中的抗菌效果及其分子机制,为开发新型抗菌药物提供更全面的理论支持。

参考文献:

[2]罗丽娟,王静,陈文娟,等.儿童神经外科术后细菌性脑膜炎临床分析[J].中华儿科杂志,2023,61(8):690-694.

[17]肖洁,张秀琴,杜文芳,等.茶多酚EGCG抑制大肠杆菌O157:H7生物膜研究[J].武汉轻工大学学报,2017,36(3):33-36.

[18]余生玲,申光辉,黄廷,等.藤椒精油对腐败解淀粉芽孢杆菌DY1a生物被膜的抑制作用[J].微生物学通报,2022,49(6):2135-2151.

[20]包佳婷.鲍曼不动杆菌耐药性与生物被膜形成的关系及抗菌药物对生物被膜的影响[D].天津:天津医科大学,2019

基金资助:国家自然科学基金青年科学基金项目(81903369);湖南省大学生创新创业训练计划(D202405231928162926);

文章来源:罗宇辰,李昀霏,罗湘,等.表没食子儿茶素没食子酸酯抑制鲍曼不动杆菌ABK450生物被膜形成[J].中南医学科学杂志,2025,53(04):565-569.