破骨细胞主要来源于骨髓巨噬细胞(bone marrow macrophages, BMMs),其前体细胞在巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)和核因子受体配体激活因子(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand, RANKL)刺激下可分化为成熟破骨细胞，并发挥骨吸收功能[1]。破骨细胞介导的骨吸收是维持骨重塑和骨代谢稳态的重要因素。然而病理状态下破骨细胞常被过度激活，骨骼疾病中如骨质疏松、骨关节炎和骨坏死等，都与破骨细胞的过度活跃相关[2-3]。活跃的破骨细胞介导的骨吸收增加是骨组织微结构破坏的病理基础，进而导致机体骨密度和骨质量下降、骨脆性增加等[4]。现阶段，临床常用抗破骨细胞药物包括双膦酸盐类及雌激素替代类药物等，然而这些药物往往伴随着一定不良反应[5]。因此，有必要探索具有高效性和安全性的潜在抗破骨细胞活性药物。

龙血竭Resina Draconis是取自于龙血树Dracaena cochinchinensis(Lour.) S. C. Chen树脂加工而成的一味传统中药材，具有活血化瘀、消炎止痛、生肌敛疮之功效[6]。现代药理研究表明龙血竭具有抗炎、抗氧化、抗凝血、抗凋亡、镇痛和神经保护等多种生物活性[7],然而其在肌肉骨骼疾病中的相关研究较少。课题组前期研究发现从龙血竭中提取的特定活性成分具有良好的抗骨质疏松作用[8-9]。剑叶龙血素A(Cochinchinenin A,CCA)同样是龙血竭重要的药效物质之一，现有研究表明CCA可提高痛阈，发挥良好的镇痛效果[10-11]。但目前关于CCA对破骨细胞分化的作用及其机制的研究尚未见报道。本研究拟通过网络药理学方法探索CCA干预破骨细胞分化的潜在作用靶点及相关机制，并通过分子对接和体外实验验证，以阐明CCA抑制破骨细胞分化的作用机制。

1、材料与方法

1.1材料

剑叶龙血素A(中国Chemfaces公司);α-MEM培养基；胎牛血清(FBS);MTS测定试剂盒；巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、RANKL(美国R&D system);青霉素和链霉素(P/S)(美国Sigma公司);Integrinβ3抗体、CTSK抗体、β-actin抗体、NFATc1抗体(美国Santa Cruz生物科技公司);c-Fos抗体、p38抗体、p-p38抗体、IκB-α抗体(美国Cell Signaling科技公司)。

1.2方法

1.2.1 CCA作用破骨细胞分化的靶点收集与筛选：

于PubChem数据库获取CCA结构式，将结构式导入Swiss Target Prediction在线网站获取CCA的潜在作用靶点。以“osteoclast differentiation”和“osteoclastogenesis”为关键词，通过KEGG、PubMed和AmiGO数据库获取破骨细胞分化相关靶点。通过韦恩图对CCA作用靶点与破骨细胞分化相关靶点取交集，所得交集基因即为CCA干预破骨细胞分化的潜在作用靶点。

1.2.2蛋白互作(PPI)网络构建：

将取得的作用靶点导入STRING数据库进行PPI网络分析，得到相应数据，并使用Cytoscape软件进行PPI网络可视化。

1.2.3功能富集分析：

将CCA作用破骨细胞分化的靶点导入Metascape在线网站进行GO功能及KEGG通路富集分析，P<0.01认为差异具有统计学意义，并用气泡图展示排名靠前的通路。

1.2.4分子对接：

从Pubchem数据库获取CCA 3 D结构式，并从PDB数据库下载关键蛋白结构域。使用Auto Dock Tool软件对CCA和关键靶点进行分子对接，验证CCA与靶点的相互作用活性，并使用PyMol软件进行可视化。

1.2.5小鼠BMMs分离和培养：

取6周龄C57BL/6雄性小鼠，麻醉后脱颈处死，取双侧下肢浸泡于75%乙醇中，转移至超净台剔除残留肌肉。切除两端骨骺，充分冲洗髓腔，将骨髓悬液用滤网过滤，离心后重悬，用含体积分数10%FBS、1%P/S和含50 ng/mL M-CSF的α-MEM培养基培养，每2 d更换一次液体，直至BMMs成熟。

1.2.6细胞毒性实验：

将分化成熟的BMMs以3×103个/孔种于96孔板中。第2天，加入不同浓度的CCA(0、20、40μmo/L)并培养2 d,然后加入20μL的MTS试剂于黑暗中孵育，使用酶标仪检测孵育2 h后450 nm处的吸光度值，根据记录的数据进行统计分析。

1.2.7抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAcP)染色：

BMMs分化成熟后，以5×103个/孔种于96孔板，培养过夜。第2天，加入50 ng/mL的RANKL诱导BMMs向破骨细胞分化，并用不同浓度的CCA(20、40μmol/L)分别干预细胞，同时以等体积的PBS干预细胞作为阳性对照，培养至破骨细胞分化成熟。按照说明书配制TRAcP染色液。吸出96孔板中的培养液，用1×PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛固定20 min,再用1×PBS清洗3次，向每孔中加入100μL TRAcP染色液，37℃恒温孵育30 min,继续用1×PBS清洗3次。染色完成后在导致显微镜下观察并计数阳性细胞数量，进行统计学分析。

1.2.8 F-actin染色：

如前所述，将最佳条件下的BMMs接种到96孔板中。留置过夜后，加入RANKL诱导分化，并用20μmol/L和40μmol/L浓度的CCA进行干预。在对照组中观察到成熟的破骨细胞后用4%的PFA固定细胞。用0.5% Triton X-100渗透细胞膜，再用5% FBS在室温下阻断2 h。随后使用罗丹明标记鬼笔环肽对肌动蛋白环在室温下避光染色1 h,同时使用抗荧光淬灭封固液(含DAPI)对细胞核染色10 min。使用荧光显微镜迅速进行观察及拍摄，并用Image J软件进行统计。

1.2.9 Western Blot实验：

将分化成熟的BMMs种入6孔板中，每孔的细胞密度为2×105个。分别在第1、3、5天向每孔加入50 ng/mL的RANKL诱导其向破骨细胞分化，同时加入40μmol/L的CCA及等体积的PBS干预细胞。每2 d更换一次培养液，至破骨细胞成熟，提取蛋白检测破骨细胞功能相关蛋白表达。为了检查信号通路蛋白，将分化成熟的骨髓巨噬细胞播种到6孔板中，密度为2.5×105个细胞/孔，并培养过夜。然后将细胞饥饿2 h,用CCA(40μmol/L)预处理1 h,然后用RANKL(50 ng/mL)刺激指定时间。刺激后使用RIPA裂解液裂解细胞，提取细胞蛋白。然后用SDS-PAGE分离蛋白质至硝酸纤维素膜上，配制5%BSA溶液阻断非特异性结合，在4℃环境过夜孵育抗体，随后孵育相应二抗1 h。使用Gel-pro和ImageJ软件对图像进行定量分析。

1.3统计分析

使用GraphPad Prism 8.4.3对所有数据进行分析，用t检验分析两组间的显著性差异，两组以上数据用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 CCA作用破骨细胞分化靶点筛选

CCA结构式(C17H18O4)如图1A所示，通过检索Swiss Target Prediction数据共获得潜在靶点114个；通过KEGG、PubMed和AmiGO数据库检索去重后得到319个破骨细胞分化相关靶点，韦恩图取交集后得到20个CCA干预破骨细胞分化的潜在作用靶点(图1B)。

2.2 PPI网络构建

将20个潜在靶点导入STRING数据库，获得PPI图(图1C);使用Cytoscape软件进行可视化，获得PIK3CA、MTOR、ESR1及MAPK1等关键靶点(图1D)。

图1CCA作用破骨细胞靶点筛选及PPI网络构建

2.3功能富集分析

通过Metascape在线网站对20个作用靶点进行功能富集分析，利用气泡图展示排名靠前的通路。结果发现涉及到的通路有PI3K-Akt、MAPK、HIF-1信号通路、破骨细胞分化及肌动蛋白细胞骨架的调节等(图2A);生物过程主要涉及磷酸化调节、对生长因子的反应和MAPK级联调控等，细胞组分主要涉及受体调节和磷脂酰肌醇3-激酶复合物等，分子功能主要涉及蛋白激酶活性和血管内皮生长因子受体活性等(图2B)。此外，桑基图展示了这些靶点和通路之间的关系(图2C)。这些发现表明CCA可能通过干预MAPK通路和肌动蛋白细胞骨架组成从而调节破骨细胞分化。

图2CCA潜在作用靶点功能富集分析

2.4分子对接

使用Auto Dock Tool软件将CCA与关键靶点PIK3CA、MTOR、MAPK1及ESR1进行分子对接，其结合能分别为-7.4、-8.1、-6.6、-7.6 kcal/mol,表明以上复合体能够形成稳定的对接模型(图3)。

2.5 CCA抑制RANKL诱导的破骨细胞分化

为了明确CCA对破骨细胞分化的影响，采用20、40μmol/L药物干预RANKL诱导的BMMs的体外分化过程(图4A)。细胞毒性试验表明CCA对BMMs的增殖没有毒性(图4B),而CCA的干预能够显著抑制破骨细胞分化(图4C)。

2.6 CCA抑制破骨细胞F-actin环的形成

为了验证CCA对破骨细胞肌动蛋白细胞骨架的影响，使用罗丹明、细胞骨架蛋白和DAPI 3种染色试剂分别对破骨细胞的不同成分进行染色。其中破骨细胞的F-actin环呈现为红色，细胞骨架蛋白为绿色，细胞核为蓝色。与RANKL组相比，CCA能使完整的富含细胞骨架蛋白的肌动蛋白环破裂，对破骨细胞的形成具有抑制作用(图5)。

图3分子对接模型

图4CCA抑制破骨细胞分化

图5CCA抑制破骨细胞F-actin环的形成(破骨细胞F-actin环染色结果)

2.7 CCA抑制破骨细胞形成及功能相关蛋白表达

采用抑制作用最强40μmol/L浓度，用CCA干预RANKL刺激下的破骨细胞分化过程，结果显示从第3天起，CCA可明显抑制破骨细胞形成相关的Integrinβ3、NFATc1、和c-Fos蛋白的表达，同时抑制与骨吸收功能相关的CTSK蛋白的表达(图6)。

图6CCA抑制破骨分化相关蛋白表达

Fig.6CCA inhibited the protein expressions in osteoclast differentiation

2.8 CCA抑制RANKL诱导的MAPK和NF-κB信号通路

为了验证CCA抑制作用的分子机制，在RANKL刺激的不同时间梯度用CCA进行干预。Western blot分析显示，RANKL刺激最早在不到30 min内抑制了p38的磷酸化并且降低了IκB-α的降解，表明CCA对p38/MAPK和NF-κB通路具有抑制作用(图7)。

图7CCA抑制p38的磷酸化和IκB-α的降解

3、讨论

破骨细胞的过度激活可导致佩吉特骨病、骨质疏松和骨坏死等骨骼疾病[12-14]。抑制破骨细胞的分化及功能，减轻其过度激活是治疗骨丢失的一种有效治疗手段，然而目前治疗手段有限，且存在不良反应难以长期使用[15]。从中药中提取天然化合物是新药开发的重要来源，一些天然化合物在体内外被证实具有良好的抑制破骨细胞成熟和骨吸收作用，有望为骨质疏松等病提供治疗新思路[16-17]。CCA是来源于“活血圣药”龙血竭的一种天然化合物，本研究通过网络药理学和体外实验首次证实了CCA对破骨细胞分化的抑制作用。

网络药理学和分子对接是探讨中药作用机制的有效辅助手段，广泛用于中药药理作用研究[18]。网络药理学结果表明CCA作用于破骨细胞分化的潜在靶点主要富集于MAPK和肌动蛋白细胞骨架调节等信号通路，分子对接也表明CCA与PIK3CA、MTOR、MAPK1及ESR1关键靶点具有良好结合性能。体外实验证实CCA可显著抑制破骨细胞F-actin环的形成，抑制与破骨细胞形成相关的Integrinβ3、NFATc1和c-Fos蛋白的表达，同时抑制与骨吸收功能相关的CTSK蛋白的表达，且通过p38/MAPK和NF-κB通路调节破骨细胞分化。

NFATc1是破骨细胞分化的主要转录调节因子，NFATc1缺失可导致胚胎干细胞无法形成破骨细胞[19];在小鼠模型中，造血细胞中NFATc1表达下降可导致骨量增加和破骨细胞形成减少[20]。此外，由NFATc1直接调控的c-Fos和CTSK等破骨细胞特异性蛋白均被CCA所抑制。小鼠BMMs与RANKL结合后可激活一系列信号通路，其中MAPK通路与RANKL诱导的破骨细胞分化密切相关，其家族成员包括ERK、JNK和p38[21]。在RANKL刺激下，ERK、JNK和p38被磷酸化，本研究发现CCA可显著抑制p38的磷酸化从而抑制破骨细胞形成。NF-κB通路也是破骨细胞形成中的关键通路，IκBα的降解对破骨细胞转录因子c-Fos的表达至关重要[22]。短时间梯度的Western blot结果显示CCA可在10 min及60 min逆转IκB-α的降解，表明其对NF-κB活性有抑制作用。

综上所述，本研究表明CCA可通过抑制破骨细胞F-actin的形成和调节p38/MAPK和NF-κB通路从而抑制破骨细胞分化，为抗破骨活性相关药物开发提供了理论和实验依据。

参考文献:

[1]智信,陈晓,苏佳灿.破骨细胞研究新进展[J].中国骨质疏松杂志,2019,25(9):1327-1330.

[3]莫亮,王章正,周驰,等.破骨细胞介导的股骨头坏死骨髓水肿疼痛及塌陷机制[J].西安交通大学学报(医学版),2023,44(6):950-957.

[5]陈镜,冯正平.骨质疏松症治疗药物研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2021,27(5):776-780.

[6]张越,宋美芳,李海涛,等.珍稀名贵药材龙血竭基原及同属植物的DNA条形码鉴定研究[J].中国中药杂志,2021,46(9):2173-2181.

[7]陈品秋,班玮康,王文艳,等.龙血竭及其主要活性成分对脑缺血的药理作用与机制研究进展[J].中草药,2023,54(18):6172-6184.

[10]朱利兰.剑叶龙血素A衍生物对小鼠镇痛活性的QSAR模型[J].广州体育学院学报,2021,41(3):91-93.

[11]王晓晶,杨淬,王兴红,等.剑叶龙血素A衍生物的合成及其镇痛活性研究[J].云南大学学报(自然科学版),2018,40(4):748-754.

[14]莫亮,王章正,马超,等.基于生信分析构建骨质疏松氧化应激相关miRNA-mRNA调控网络[J].华中科技大学学报(医学版),2023,52(5):641-648.

[15]瓦俄,方珏敏,许青.成骨与溶骨性骨转移机制差异及靶向药物进展[J].现代肿瘤医学,2017,25(22):3699-3703.

[18]卫博凯,胡静.基于中医传承辅助平台与网络药理学探析中药干预新型冠状病毒感染后遗症肺纤维化的作用机制[J].中草药,2024,55(1):190-204.

基金资助:国家自然科学基金(82104883);广州中医药大学第一附属医院中青年骨干人才培育项目(中医医院[2023]186号);广州市科技计划项目优秀博士续航项目(2024A04J9998);

文章来源:莫亮,卫杨文祥,周月惠,等.剑叶龙血素A对破骨细胞分化影响的研究[J].中国骨质疏松杂志,2024,30(10):1405-1411.