Cremophor® RH 40是一种在聚乙氧基化链中含有平均40个乙氧基单元的聚乙氧基化氢化蓖麻油，由甘油聚乙二醇羟基硬脂酸酯与脂肪酸甘油聚乙二醇酯形成亲脂端与聚乙二醇和甘油乙氧基化物亲水端组成的双亲性高分子表面活性剂。在水中可自发形成纳米胶束，具有增溶能力强、跨膜转运效率高、生物相容性好等特点［1-2］。普朗尼克F127由聚氧乙烯（PEO）单元和聚氧丙烯（PPO）嵌段组成，并具有PEO100-PPO65-PEO100的多功能三嵌段组合物，疏水性PPO链段可以自发形成疏水性核心，疏水性药物可以结合到其内部微环境中［3］。这种纳米胶束由聚合物自组装形成核-壳结构的纳米粒，疏水性链段在内部聚集成核成为难溶性药物贮库，亲水性链段则在表面分布成壳赋予微粒稳定性。研究发现纳米胶束的载药能力和稳定性是制剂重要表征参数。此外，粒径分布、电荷等也是评价胶束的关键指标，这些指标与胶束在体内ADME过程等密切相关［4-5］。然而，由于聚合物分子的结构类型和长度限制，部分单聚合物胶束往往存在载药量低、体内稳定性不够等性能缺陷，采用两种或两种以上两亲性高分子聚合物的组合构建混合聚合物胶束(mixed polymer micelles，MMs)，是解决这些问题的有效方法［6］。姜黄素（Curcumin，Cur）是从姜黄等根茎中分离出的二酮类活性物质之一，具有多种药理活性，如抗炎、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、利胆等［7-9］、毒副作用小，临床试验结果显示姜黄素在8.0~12.0 g/d的剂量也是安全的［10］。但姜黄素为BCSⅣ类药物，不溶于水，膜通透性差，而且稳定性也差，在肠道吸收过程及肝中存在严重的代谢转化，致使其口服几乎不吸收，限制了其临床应用。据报道，姜黄素在pH 5.0水溶液中的最大溶解度为11 ng/mL。姜黄素在大鼠中的口服生物利用度非常低，仅为1%［10］。在临床试验中，直到使用3.6 g的剂量，才能达到可计量的血清水平［11］。因此，如何提高姜黄素的溶解度及渗透性，进而提高其口服生物利用度一直是药剂工作者面临的问题和挑战。基于此，本课题前期采用薄膜分散法优化了CrRH 40和F127比例，制备了Cur-Cr RH 40/F127-MMs，本实验拟对Cur-Cr RH 40/F127-MMs进行理化表征；并通过大鼠药代动力学评价Cur-Cr RH40/F127-MMs口服生物利用度。

1、材料

1.1仪器

Fluko FA25高剪切分散乳化机（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）；MASTERSIZER2000型Malvem纳米粒度仪（英国Malvern公司）；Nano-S型Malvem纳米粒度仪（英国Malvern公司）；Pandaplus 2000型 高 压 均 质 机（ 意 大 利Niro Soavi）；jem2100透射电镜（日本电子株式会社）；Agilent1290色谱系统（美国捷伦科技有限公司）；质谱系统 为AB SCIEX Q-TRAP 4500，连PEAKSCIENFIC氮气发生器，工作站为Analyst 1.6.1CF1524R（美国AB公司）；台式微量高速冷冻离心机（Scilogex公司）；IKA genius 3旋涡混合器（德国IKA集团）；BS124S型电子分析天平（德国Sartorius公司）。

1.2药品与试剂

姜黄素（批号HXJHS20200710，纯度≥98%，成都埃法生物科技有限公司）；甲醇（色谱纯，德国Merck公 司 ）；Cremophor®RH 40（ 德 国 ）；姜黄 素 对 照 品（ 批 号AF9102903，纯 度 ≥98%，成都埃法生物科技有限公司）；替硝唑（批号YO1S7C20290，纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；甲酸（色谱级，批号20180418，天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为超纯水。1.3动物SD大鼠，雄性，体重180~220 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK（湘）2019-004。标准环境下适应性饲养1周。

2、方法与结果

2.1 Cur-Cr RH 40/F127-MMs纳米胶束的制备和表征

2.1.1  Cur-Cr RH 40/F127-MMs纳米胶束的制备 

精密称取姜黄素200 mg、Cremophor RH 40 1.6 g、F1270.4 g，加甲醇溶解并定容至100 mL，置于旋转蒸发仪的梨形瓶中，调节适当的转速，旋转蒸发，促使纳米胶束均匀附着在梨形瓶内壁，可见一层淡黄色的薄膜。再将梨形瓶置于冰水浴中，真空干燥尽量除去残留的甲醇。 加入100 mL蒸馏水，于37℃水温条件轻微摇晃使薄膜水化，水化30 min，再超声处理（功率200 W，温度37℃）10 min，室温下放置1 h后，采用0.22 μm微孔滤膜进行过滤，即得Cur-Cr RH 40/F127-MMs纳米胶束。

2.1.2 粒径分布、Zeta电位和微观形态观察 

吸取Cur-Cr RH 40/F127-MMs纳 米 胶 束5 mL至 西林瓶中，用激光笔从西林瓶的一侧照射，观察胶束粒子的丁达尔现象（图1）；吸取1 mL Cur-Cr RH40/F127-MMs纳米胶束加入适量体积的蒸馏水稀释，以马尔文激光粒径测定仪测定Cur-NCS的粒径与粒径分布；以Malvem纳米粒度仪测定CurNCS的Zeta电位（图2A，图2B）。将Cur-Cr RH40/F127-MMs纳米胶束稀释到适当浓度，滴在喷碳铜网上，放置10 min使其吸附于铜网上，再滴加1%磷钨酸将其负染2 min，置于透射电镜下观察胶束的形态（图2C）。结果显示Cur-Cr RH40/F127-MMs纳米胶束粒径大小均匀、形态为规则的圆球形，平均粒径为（17.23±1.02）nm，PDI为0.153±0.007，Zeta电位为（-9.62± 0.13）mV。

图1丁达尔现象A CB

图2 Cur-NCS的电位、粒径分布及电镜图

2.1.3 包封率及载药量 

采用HPLC色谱法测定胶束中姜黄素的载药量和包封率。色谱条件如下：TitankC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相比例为乙腈-0.5%醋酸水（58∶42），流速为1.0 mL/min；检测波长为430 nm，柱温为30℃。精密吸取胶束溶液100μL，加入无水乙醇稀释50倍，使胶束溶解以释放药物，将上述药物溶液稀释到适宜浓度，于12 000 r/min离心10 min,取上清液10μL进样，测定药物峰面积，根据标准曲线计算药物浓度（A=42.701C-38.642，R2=0.999 9）。并按照下述公式计算载药量和包封率：载药量=［Wm/（Wc+Wf）］×100%；包封率=（Wm/Wf）×100%。其中，Wm为胶束中药物质量，Wc为载体质量，Wf为投药量。测得载药胶束中姜黄素的包封率为（89.43±3.07）%，载药量为（12.78±0.31）%（由于姜黄素是以疏水性小分子包载于自组装胶束中，其本身溶解度很低，故不考虑极少量游离姜黄素的量）。

2.2体外释放特性研究选用透析法研究

姜黄素原料药（Cur-API）及Cur-Cr RH 40/F127-MMs的体外释放特性研究。取浓度相同的原料药混悬液及Cur-Cr RH 40/F127-MMs各1 mL，置于透析袋内（截留分子质量为8 000 Da），平行3份，在温度为37℃、转速为100 r/min的漏槽条件下，研究药物从胶束中的释放行为，释放介质为含1%土温-80的pH7.4 PBS 100 mL。固定时间点取样1 mL，并补充相同体积和温度的空白介质。高速离心后取上清液，HPLC法测定姜黄素的含量，计算累积释放百分率，并绘制胶束释放曲线，结果见图3。Cur-Cr RH 40/F127-MMs呈快速释放，且96 h最终累积释放率高；Cur-API呈缓慢释放趋势，但96 h最终累积释放率低。总体而言，两者相比较，Cur-Cr RH40/F127-MMs体外释放药物的最终累积释放率显著高于Cur-API，具有良好的缓释性能。

图3药物释放累积图

2.3大鼠体内药代动力学研究

2.3.1  LC-MS/MS条 件 

色 谱 条 件：ACE Excel 2C18柱（100 mm×2.1 mm，2 μm）；流 动 相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0~1.5 min，65%B；1.5~2.0 min，65%→85%B；2.0~3.0 min，85%→95%B；3.0~4.0min，95%B；4.0~4.1min，95%→20%B；4.1~6.0 min，20%B）；流速：0.3 mL/min；柱温：25℃ ；进样量：2μL。质谱条件：采用电喷雾离子化源（ESI）正离子模式扫描，检测模式为多反应检测（MRM），离子化电压（IS）为5 500 eV；离子源温度（TEM）为550℃ ；气 帘 气（CUR） 为10 psi；喷 雾 气（GS1）为50 psi；助加热气（GS2）为45 psi，扫描方式为多离子反应监控（MIM），姜黄素：m/z369.1→285.2；替硝唑m/z 248.0→121.0。

2.3.2 检测限和定量限 

取线性最低点对照品溶液对倍稀释，以S/N=3计，姜黄素最低检测限为0.01 ng/mL。以S/N=10计，姜黄素定量限为0.03 ng/mL。2.3.3 血浆样品的处理 取血浆样品60 μL，内标10 μL，涡旋1 min，混匀，再加入甲醇170 μL，涡旋2 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液120 μL加入新EP管中，二次离心5 min，取上清液80 μL，·85·JOURNAL OF JIANGXI UNIVERSITY OF CM 2025 Vol. 37 No.1●中药研究●采用LC-MS/MS法测定。

2.3.4 方法专属性考察 

如图4所示，配制一定浓度的姜黄素进样，得色谱图A；取空白大鼠血浆60 μL，按“2.3.3”项下方法操作，得色谱图B；取60 μL一定浓度的姜黄素对照品溶液，加入60 μL空白血浆中，按“2.3.3”项下方法操作，得色谱图C；取给予姜黄素的大鼠血浆60 μL，按“2.3.3”项下方法操作，得色谱图D。在选定的色谱条件下，Cur和内标物替硝唑的保留时间分别为2.74、1.53 min，在此保留时间下溶出介质无色谱峰，即溶出介质不干扰Cur的测定。姜黄素和内标之间有较好的分离度，空白血浆中无内源性杂质扰样品峰，姜黄素和内标峰形良好。由此证实，该色谱条件专属性强较好。

2.3.5 储备液、Cur标准工作液 

精密称量10 mgCur和5 mg替硝唑对照品分别用甲醇溶解定容至

图4各样品色谱图

50 mL、10 mL容量瓶中，配制成质量浓度为0.2、0.5 mg/mL储备液，加入甲醇稀释制备成质量浓度分 别 为0.4、2、10、50、100、200、400、500、800、10 000 ng/mL系列的Cur标准工作液。

2.3.6 标准曲线的制备 

精密吸取空白血浆60 μL10份，分别加入20 μL“2.3.5”项下配制的Cur标准工作液及10 μL内标溶液，使姜黄素质量浓度分别为0.03、0.16、0.83、4.16、8.33、16.67、33.33、41.67、66.67、83.33 ng/mL。以Cur质量浓度（X）作为横坐标，相应Cur峰面积与内标峰面积比值（Y）作为纵坐标，进行线性回归。计算得Cur的线性回归方程为Y=0.040 4X+0.034 2（R2=0.999 3），结果表明Cur的质量浓度在0.03~83.33 ng/mL范围具有良好的线性关系。

2.3.7 提取回收率 

精密吸取空白血浆60 μL，分别加入低、中、高（2、50、800 ng/mL）的Cur标准工作液20 μL，使姜黄素质量浓度分别为0.17、4.17、16.67 ng/mL，按“2.3.3”项下处理并测定，每个浓度平行操作5管，测得的色谱峰面积与空白血浆经提取后加入相应浓度对照品溶液的峰面积比值即为提取回收率。Cur低、中、高质量浓度的提取回收率分别为87.66%、89.40%、94.48%，RSD分别为A BC D2.47%、9.53%、5.10%，均符合要求。

2.3.8 基质效应 

精密吸取空白血浆60 μL经提取后，分别加入低、中、高（2、50、800 ng/mL）的Cur标准工作液20 μL，使姜黄素质量浓度分别为0.17、4.17、16.67 ng/mL，进样测定姜黄素峰面积为A；取相应的等量对照品溶液，进样测得峰面积为B。以A/B×100%分别计算待测物的基质效应因子。基质效应ME/%=A/B×100，若ME在85%~115%范围内，则可认为没有基质效应。Cur低、中、高质量浓度的基质效应分别为93.34%、94.50%、91.80%，RSD分别为4.49%、6.90%、8.69%，均符合要求。

2.3.9 精密度试验 

精密吸取空白血浆60 μL，分别加入低、中、高（2、50、800 ng/mL）的Cur标准工作液20 μL，按“2.3.3”项下处理后进样测定，以一天内3次测定结果计算日内RSD，以一周内5天测定结果计算日间RSD。Cur低、中、高质量浓度的日内精密度RSD分别为5.78%、2.22%、1.88%；日间精密度RSD分别为6.67%、2.88%、2.49%，均符合要求。

2.3.10 给药方法及血样采集 

取健康雄性SD大鼠12只，体重为（200±20 g），随机分为2组，每组6只。实验前禁食12 h，分别灌胃给予Cur-API和Cur-MMs，灌胃剂量均为Cur 60 mg/kg。分别在给药后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h于大鼠眼眶处静脉取血约0.5 mL，置抗凝EP管中，在4℃条件下，以10 000 r/min离心10 min，收集血浆，-20℃保存备用。

2.3.11 血药浓度测定以及药动学参数拟合 

按照“2.3.10”方法收集血样后，以“2.3.3”项下方法处理，按“2.3.1”项下色谱条件进样，计算血药浓度。将得到的Cur血浆药物浓度数据用DAS 3.3药物代谢动力学软件进行参数拟合，采用非房室模型的统计矩法对各组血药浓度进行数据分析，计算药代动力学参数。

2.3.12 结果 

大鼠单次灌胃给予Cur-API 0.5%CMC-Na混 悬 液、Cur-MMs后 平 均Cur血 药 浓度-时间曲线见图5，药代动力学参数见表1。与Cur-API相比，Cur-MMs的Cur血药浓度有明显的提高，Cmax具有极显著提高，为原料药的10.8倍（P<0.001）；Cur-MMs的AUC0-t为原料药的9.2倍（P<0.001）；Cur-MMs的AUC0-∞是原料药的6.5倍（P<0.01）；Tmax显 著 延 迟（P<0.01）；T1/2和MRT有所缩短。

图5 Cur口服后血药浓度-时间曲线

表1大鼠灌胃60 mg/kg Cur后的体内药代动力学参数

3、讨论

基于纳米技术的药物递送系统已被用于克服有限的生物利用度并确保给药后更大的生物分布。在各种纳米载体中，具有固有稳定性和易于配制的聚合物胶束是理想的肿瘤靶向载体，其结构适合包封疏水性或低水溶性药物［12］。纳米胶束是一种有前途的制备方法，可用于姜黄素的持续和受控递送，比游离姜黄素显示出更显著的抗癌活性［13］。F127因其安全性、循环周期长和较好生物相容性而被广泛用于纳米颗粒的制备，但其使用受限于溶解性差、稳定性差，难以单独使用。混合胶束具有作为高效药物载体的巨大潜力，用于增强药物包封和递送参数，除了降低CMC值外，混合胶束还显示出其他协同特性，例如增加的载药能力和胶束稳定性，优于单个组分［14］。根据报道，与纯F127胶束相比，包含F127的混合胶束具有更高的溶解度，产生可调节的缓释，表现出良好的生物相容性［14-15］。单一载体组成的纳米胶束的药物释放率较低，溶解性较差，可通过添加Cremophor® RH40组成混合纳米胶束改善［16］。本研究制备了姜黄素载入氢化蓖麻油聚氧乙烯醚RH 40/普朗尼克127混合纳米胶束，并对其物理性质进行表征及在大鼠体内的药代动力学进行评价。研究结果显示，制备的Cur-Cr RH40/F127-MMs粒径小、包封率高及载药量大，形态呈规则的圆球形。在大鼠体内的药代动力学研究表明，与Cur-API组相比，Cur-Cr RH 40/F127-MMs组姜黄素的主要药动学参数Cmax、AUC0-t、AUC0-∞均明显增加，Tmax显著延长。尽管姜黄素纳米胶束T1/2和MRT相对缩短，但其能获得相对更高的达峰浓度和更持久地维持姜黄素血药浓度在相对较高水平，这对于获得有效而持久的药物疗效有重要意义。在图4D中，出现了除了姜黄素和内标物之外的两个质谱峰，推测是姜黄素的代谢产物。姜黄素在小鼠、大鼠和人类体内被代谢为姜黄素-O-葡萄糖醛酸苷和姜黄素-O-硫酸盐等［17-18］。有一级和二级质谱数据表明姜黄素的各级离子碎片与姜黄素-O-葡萄糖醛酸苷和姜黄素-O-硫酸盐的各级离子碎片相似［19］。在选择m/z为369.1→285.2的离子对用以检测姜黄素的浓度时，可能同时也检测到了姜黄素-O-葡萄糖醛酸苷和姜黄素-O-硫酸盐。胶束是热力学稳定的胶体溶液，由两性分子在高于临界胶束浓度（CMC）的水中自组装而成。在结构上，胶束由亲水壳和疏水核组成，可以装载疏水药物胶束的大小通常在20~100 nm之间，这允许胶束从肿瘤血管壁溢出并进入癌细胞，并能够逃避网状内皮系统（RES）的清除，并增加药物的体循环时间［20］。本研究制备的姜黄素纳米胶束表现出优良的药物代谢动力学特性，对克服姜黄素自身溶解度低和渗透性差的缺点，以及提高药物临床疗效有巨大的潜在价值。

参考文献:

[9]顾巧丽,蔡燕,杨惠林,等.姜黄素对小鼠爆发性肝炎的作用研究[J].现代免疫学, 2015, 35(5): 358-361.

[19]王媛,刘美娟,王宏进,等.基于UPLC-Q-Extractive Orbitrap MS鉴定姜黄提取物在大鼠体内的代谢产物[J].质谱学报, 2022, 43(2):155-167.

基金资助:现代中药制剂教育部重点实验室开放基金项目(Zdsys-202307);

文章来源:王勇平,黄福满,汪新娌,等.姜黄素装载的混合聚合物胶束物理表征､体外释放及药代动力学研究[J].江西中医药大学学报,2025,37(01):82-87.