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金银花-连翘成分在双黄连颗粒制备过程中的迁移情况

2020-06-22 438 上传者：管理员

摘要：目的全面评价双黄连颗粒制备过程中金银花、连翘成分迁移情况,明确影响其质量的关键工序。方法采用HPLC建立金银花-连翘水提液指纹图谱及同时测定绿原酸、连翘苷、连翘酯苷A的方法,对金银花-连翘工艺过程(包括提取、提取液浓缩、醇沉、醇沉液浓缩、干燥)进行相似度及3个指标成分含量比较分析。结果金银花-连翘水提液指纹图谱中确定18个共有峰,通过对照品指认出7个峰,10批水提液指纹图谱与对照指纹图谱的相似度在0.745～0.991,5个工艺过程指纹图谱相似度在0.999～1.000。绿原酸、连翘苷及连翘酯苷A均在提取环节损失较大,其次为醇沉、干燥、浓缩。结论药材质量、醇沉及干燥工序对金银花、连翘指标成分影响较大,生产中应对药材来源及醇沉、干燥工艺参数进行严格控制,为含金银花、连翘的中药制剂工艺质量控制提供参考。

关键词：
双黄连颗粒
成分迁移
指纹图谱
药物
金银花-连翘
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清代温病大家吴鞠通擅长用金银花、连翘，并著《温病条辨》，其书载方剂204首，其中金银花-连翘药对出现的方剂达26首[1]。双黄连制剂由《银翘散》精简化裁而来，为临床应用较为广泛的传统中成药，由金银花、连翘、黄芩3味药材组成，收载于2015年版《中国药典》一部，具有疏风解表、清热解毒的功效，剂型包含口服液、片剂、栓剂、胶囊剂、颗粒剂和滴眼剂[2]。

近年来，有学者以指标成分含量、药效作用值为指标，对双黄连制剂（口服液、片剂、颗粒剂）进行再评价研究，推测金银花、连翘干燥时间对其有效成分有一定影响而导致药效不同[3,4]。苏青等[5]研究黄芩静置时间、黄芩中间体、金银花及连翘浸泡工艺、精制、浓缩工艺及剂型进行多方面再评价，结果表明绿原酸在醇沉过程损失较大。王洋等[6]研究双黄连颗粒中金银花连翘的提取工艺，对药典中没有明确规定的煎煮加水量、加醇时药液温度、加醇速度、搅拌速度进行了优选。金银花、连翘含有多种化学成分及药理作用[7,8]，而对于金银花-连翘提取工艺过程尚缺乏较为系统的研究。

本文采用HPLC指纹图谱同时测定绿原酸、连翘苷、连翘酯苷A3种有效成分，对金银花-连翘工艺过程（包括提取、提液液浓缩、醇沉、醇沉液浓缩、干燥环节）进行成分迁移研究，与前一工艺步骤比较，计算其动态损失率，明确影响其质量的关键工序，由此为含金银花、连翘的中药制剂工艺变更质量控制提供参考。

1、仪器与试药

Ultimate3000高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）；YP5002型电子天平（精度：0.01g，上海佑科仪器仪表有限公司）；MS105DU型电子分析天平（精度：0.01mg，梅特勒-托利多仪器有限公司）；SB-5200DTD型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

绿原酸（批号：110753-201817，质量分数以96.8%计）、连翘苷（批号：110821-201816，质量分数以95.1%计）、连翘酯苷A（批号：111810-201707，质量分数以97.2%计）、芦丁（批号：100080-201811，质量分数以91.7%计）对照品（中国食品药品检定研究院）；新绿原酸（批号：B21396）、隐绿原酸（批号：B21587）、连翘脂素（批号：B20726）对照品（上海源叶生物科技有限公司，质量分数均≥98%）。甲醇（色谱级，美国Fisher公司）；水为娃哈哈纯净水；10批金银花连翘药材信息见表1。

表1金银花-连翘药材信息

2、方法与结果

2.1指纹图谱

2.1.1色谱条件

色谱柱：AgilentZORBAXEclipseC18(4.6mm×250mm,5μm），流动相：甲醇（A)-0.1%磷酸（B）梯度洗脱（0～5min,25%～30%A;5～25min,30%～35%A;25～30min,35%～40%A;30～40min,40%～45%A;40～50min,45%～60%A;50～55min,60%A），检测波长：280nm，流速：1.0mL·min-1，柱温：25℃，进样量：10μL。

2.1.2各工序供试品溶液的制备

按处方比例称取金银花、连翘，加入8倍量水，温浸30min，回流提取2次，每次1.5h，分次滤过，合并滤液（取样点1：提取），80℃浓缩至相对密度1.20（取样点2：提取液浓缩），冷至40℃搅拌下缓慢加入乙醇，使含醇量达75%，充分搅拌，静置12h，滤过，合并乙醇液（取样点3：醇沉），80℃回收乙醇并浓缩（取样点4：醇沉液浓缩），70℃减压干燥（取样点5：干燥）。分别在提取、提取液浓缩、醇沉、醇沉液浓缩、干燥5个工序取样，加水溶解并稀释成含生药量相同的供试品溶液。

2.1.3混合对照品溶液的制备

精密称定绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、连翘苷、连翘酯苷A、连翘脂素、芦丁对照品适量，加50%甲醇制成含绿原酸47.24μg·mL-1、新绿原酸72.52μg·mL-1、隐绿原酸46.65μg·mL-1、连翘苷51.73μg·mL-1、连翘酯苷A99.92μg·mL-1、连翘脂素63.50μg·mL-1、芦丁54.65μg·mL-1的混合对照品溶液（均按纯度计），即得。

2.1.4精密度试验

取金银花、连翘（S1），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6针，记录色谱图。以11号色谱峰为参照，计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.0%，相对峰面积RSD均小于5.0%，表明仪器的精密度良好。

2.1.5重复性试验

取金银花、连翘（S1），按“2.1.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。以11号色谱峰为参照，计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.0%，相对峰面积RSD均小于5.0%，表明方法的重复性良好。

2.1.6稳定性试验

取金银花、连翘（S1），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8、10、12、24h进样，记录色谱图。以11号色谱峰为参照，计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.0%，相对峰面积RSD均小于5.0%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.1.7指纹图谱的建立

取金银花、连翘（S1～S10），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。将得到的S1～S10图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》进行分析，以S1图谱作为参照，采用中位数法，时间窗宽度为0.1，经多点校正后全谱峰匹配，生成对照指纹图谱（R），见图1。根据检测所得图谱，确定18个共有峰。选择保留时间适中、分离度较好的11号峰作为参照峰（S）。10批水提液指纹图谱和S1样品中5个工艺过程指纹图谱见图2。

图1金银花-连翘提取液对照指纹图谱

图210批金银花-连翘提取液指纹图谱（A）和5个工艺过程指纹图谱（B)

2.1.8共有峰的归属与指认

分别取金银花、连翘，按“2.1.2”项下方法制备单味药材水提液，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析。结果显示1、3、4、5、6、12、14、15号峰来源于金银花，2、3、6、7、8、9、10、11、13、14、16、17、18号峰来源于连翘。通过与混合对照品图谱对比，指认1号峰为新绿原酸，4号峰为绿原酸，5号峰为隐绿原酸，11号峰为连翘酯苷A,14号峰为芦丁，16号峰为连翘苷，18号峰为连翘脂素（见图3）。

图3金银花-连翘水提液指纹图谱色谱峰归属与指认

2.1.9相似度分析

10批金银花-连翘提取液指纹图谱与对照指纹图谱的相似度为0.745～0.991，见表2，表明所建立的对照指纹图谱特征性较强，不同产地、批次药材间存在一定差异，可能为环境、气候、贮藏等因素所致。5个工序指纹图谱相似度为0.999～1.000，见表3，整体面貌相似度高，表明提取液经浓缩、醇沉、干燥过程处理，特征成分总体无明显差异。

表210批提取液指纹图谱与对照指纹图谱(R)的相似度

表35个工序指纹图谱相似度

2.2含量测定

2.2.1混合对照品储备液的制备

精密称定绿原酸、连翘苷、连翘酯苷A对照品适量，加50%甲醇制成含绿原酸176.18μg·mL-1、连翘苷92.06μg·mL-1、连翘酯苷A281.10μg·mL-1的混合对照品储备液。

2.2.2线性关系考察

分别吸取“2.2.1”项下混合对照品储备液0.2、0.5、1、2、3、4、5mL于5mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，即得系列混合对照品溶液。分别吸取各系列混合对照品溶液10μL按“2.1.1”项下方法测定。以峰面积为纵坐标（y），浓度为横坐标（x）进行线性拟合，得回归方程（见表4）。由表4可以看出，各化合物在各自线性范围内与峰面积呈现良好的线性关系。

表4线性回归方程

2.2.3方法学验证

按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进行后续试验。精密度试验：连续6次精密吸取同一供试品溶液10μL测定，结果绿原酸、连翘苷、连翘酯苷A峰面积RSD<3.0%，表明仪器精密度良好；稳定性试验：在0、2、4、6、8、10、12、24h精密吸取供试品溶液各10μL，进样测定，结果绿原酸、连翘苷、连翘酯苷A峰面积RSD<3.0%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好；重复性试验：平行制备供试品溶液6份，精密吸取10μL，进样测定，结果绿原酸、连翘苷、连翘酯苷A含量RSD<3.0%，表明该方法重复性良好。

2.2.4指标成分含量测定

取金银花、连翘，按“2.1.2”项下方法制备提取液，按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算指标成分含量及与相对于前一工艺步骤的损失率。10批金银花-连翘提取液3个指标成分的含量测定结果见表5，损失率[损失率=（前工序指标成分含量-本工序指标成分含量）/前工序指标成分含量×100%]，以S1样品为例，结果见表6，成分迁移见图4，其中S1样品饮片中绿原酸含量为31.76mg·g-1，连翘苷含量为6.32mg·g-1，连翘酯苷A含量为128.70mg·g-1。结果表明，不同厂家10批次药材，金银花质量较稳定，连翘质量差别较大，可能与采收、加工、贮藏、运输等因素密切相关，生产双黄连颗粒时在应加以严格控制药材来源。金银花、连翘提取过程中指标成分在各环节中的损失率存在一定差异，绿原酸、连翘苷及连翘酯苷A在提取环节损失较大，其次为醇沉、干燥；总体来看，醇沉及干燥工序对质量影响较大，生产过程中应对醇沉、干燥参数进行严格控制。

表510批提取液指标成分含量

表65个工序指标成分损失率(S1)

图4双黄连颗粒制备过程中金银花-连翘成分迁移图

3、讨论

继2011年11月16日国家食品药品监督管理总局（CFDA）发布《已上市中药变更研究技术指导原则（一）》后，2017年9月11日CFDA又发布了《已上市中药生产工艺变更研究技术指导原则》，中药的生产工艺变更已经成为监管部门飞检重点，生产工艺中各个环节各个参数均可对其质量产生不同程度的影响。

本文建立了10批金银花-连翘提取液HPLC指纹图谱，与对照指纹图谱的相似度为0.745～0.991，表明所建立的指纹图谱特征性较强。5个工序指纹图谱相似度为0.999～1.000，表明提取液经浓缩、醇沉、干燥处理，特征成分总体无明显差异；而5个工序含量测定结果显示3种指标成分含量在醇沉、干燥步骤损失较大。

中药有效成分转移率低是中药制剂水提工艺存在的共性问题，双黄连颗粒由金银花、黄芩、连翘组成，研究表明，有机酸类是金银花重要的药效物质基础，而绿原酸含量较高；连翘主要含有苯乙醇及其苷类、木脂素类、黄酮类成分，其中连翘苷、连翘酯苷A为抗炎、抑菌的主要成分[9,10,11,12]。后续试验考察了加水倍量对绿原酸、连翘苷、连翘酯苷A转移率的影响，结果8、10、12倍量水提取结果无显著差异，因此8倍量水提取即可；而金银花、连翘配伍后提取可以增加绿原酸、连翘苷的提取率[13]，绿原酸在醇沉工艺中损失率较高，原因可能是醇沉残渣对其有较强的吸附作用，《中国药典》中通过再次洗涤残渣的方式增加绿原酸转移率，后续试验考察了洗涤倍量对绿原酸转移率的影响，发现绿原酸转移率随洗涤倍量的增加而增大，故可通过增加洗涤残渣的溶剂倍量的手段降低绿原酸在醇沉过程中的损失率；绿原酸、连翘苷、连翘酯苷A热稳定性差，有研究表明随着干燥温度升高，连翘苷、连翘酯苷A的含量皆会降低，其中鼓风干燥法损失率高于真空干燥法[14]，可以采用带式真空干燥法、喷雾干燥法、提高真空度、降低浸膏干燥层厚度等方式来降低浸膏干燥时间，以提高浸膏干燥效率，待今后进一步研究。

参考文献：

[1]刘枭,刘涛.吴鞠通配伍应用金银花､连翘的经验[J].中医药导报,2016,22(3):24-25,30.

[2]中国药典2015年版.一部[S].2015:735-741.

[3]朱红梅,刘涛,李鹏程,等.双黄连系列制剂制备工艺再评价[J].中成药,2017,39(5):1087-1090.

[4]刘钱,张文文,姚运秀,等.基于药效作用值的双黄连系列制剂再评价研究[J].中草药,2019,50(4):903-909.

[5]苏青,吴婷婷,黄雅兰,等.黄芩提取物制备过程中化学成分及药效的变化规律分析[J].中国实验方剂学杂志,2018,24(14):1-6.

[6]王洋,席珊珊.双黄连颗粒金银花､连翘提取工艺研究[J].黑龙江科技信息,2014,(16):41.

[7]吴娇,王聪,于海川.金银花中的化学成分及其药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2019,25(4):225-234.

[8]夏伟,董诚明,杨朝帆,等.连翘化学成分及其药理学研究进展[J].中国现代中药,2016,18(12):1670-1674.

[9]徐益清,许光辉,罗友华,等.复方板蓝根利咽颗粒中试工艺过程评价研究[J].中草药,2018,49(14):3261-3269.

[10]封美慧,邸欣,王鑫,等.RP-HPLC同时测定金银花､连翘药对提取物中6个成分的含量[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(16):75-79.

[11]路俊仙,梁瑞雪,林慧彬.金银花抗流感病毒作用研究进展[J].现代中药研究与实践,2018,32(5):77-81.