伊立替康（CPT-11）为半合成的喜树碱类水溶性衍生物，属于拓扑异构酶Ⅰ抑制剂，通过干扰DNA复制，引发凋亡性细胞死亡[1]。CPT-11与氟尿嘧啶类药物联用是治疗消化道肿瘤，尤其是转移期结直肠癌标准方案之一[2]。CPT-11进入体内后先被肝脏中的羧酸酯酶水解为活性代谢产物SN-38发挥抗肿瘤作用，再经尿苷二磷酸葡醛酸转移酶1A1(UGT1A1）在肝脏和肠道中转化为无活性的葡萄糖醛酸产物SN-38G解毒[1]。由于化疗药物具有治疗窗窄、个体间药代动力学性质差异大、常与其他药物联用等特点，个体化治疗药物监测（TDM）在肿瘤治疗中的应用也越来越受到重视。研究发现CPT-11和SN-38的血浆浓度水平与腹泻和中性粒细胞缺乏的发生及严重程度相关[3]，因此通过监测CPT-11及其代谢产物的血药浓度可评估代谢情况从而优化给药方案[4]。此外，血浆中SN-38G/SN-38浓度之比也可指导伊立替康用药剂量的调整[5]，因此同时测定CPT-11、SN-38和SN-38G的血药浓度对其个体化治疗十分重要。

目前国内研究报道多为高效液相色谱法检测CPT-11及其代谢产物[6,7,8]，但具有专属性较差、定量范围较窄等缺点。本文基于LC-MS/MS技术建立一种更快速、简便、灵敏的分析方法同时检测人血浆中CPT-11、SN-38和SN-38G的浓度，并应用于消化道肿瘤患者的TDM。

1、材料

1.1仪器

SHIMADZULC-20A（日本岛津公司，包括自动进样器、二元泵、柱温箱、在线脱气机），SHIMADZU8040三重四级杆串联质谱仪，LabSolutionv5.8工作站，MS-X可调式涡旋振荡仪（美国SCILOGEX),Centrifuge5804R冷冻离心机（德国Eppendorf),AL104-01电子分析天平（瑞士MettlerToledo),ResearchUV超纯水机（上海和泰仪器有限公司）。

1.2试药

伊立替康对照品（批号：A0502AS，纯度>98%）、SN-38对照品（批号：S0603A，纯度>98%）、伏立康唑对照品（批号：J1211AS，纯度>99%）（大连美仑生物技术有限公司），SN-38G对照品（批号：7-VHP-65-1，纯度>95.24%，加拿大TRC）。甲醇（色谱纯，德国Merck）；甲酸（分析纯，上海CNW）。

2、方法

2.1色谱条件

分离所用的色谱柱为WatersAtlantisT3(3.0mm×100mm,3μm），柱温35℃。流动相A为0.1%甲酸-水（v/v),B为甲醇，采用梯度洗脱（0～0.5min,20%B;0.5～0.6min,20%～75%B;0.6～5.0min,75%B;5.0～5.1min,75%～20%B;5.1～6.5min,20%B），流速为0.3mL·min-1，进样量为10μL。

2.2质谱条件

使用电喷雾电离（ESI）正离子模式下以多反应监测（MRM）模式进行分析，表1为化合物的一/二级离子和质谱特征性参数。各分析物的二级质谱图如图1。

表1各分析物及内标的离子反应对和质谱特征性参数

图1各分析物及内标的二级质谱碎裂图

2.3储备液和工作液的配制

精密称取各对照品10.00mg，置于10mL量瓶中，其中CPT-11及伏立康唑使用50%甲醇配制成储备液；而SN-38和SN-38G用DMSO-甲醇（50∶50,v/v）溶解并定容得到储备溶液，所有储备液浓度均为1.0mg·mL-1。对照品各称取两份，分别用于标准曲线和质控工作液配制。将各储备溶液用50%甲醇-水溶液逐级稀释并混合得到系列工作溶液：CPT-11浓度分别为2.5、5.0、12.5、31.25、78.12、156.3、312.5、625.0ng·mL-1,SN-38浓度分别为0.5、1.0、2.5、6.25、15.63、31.25、62.5、125ng·mL-1,SN-38G浓度分别为1.0、2.0、5.0、12.5、31.25、62.5、125.0、250.0ng·mL-1。同法制得质控（QC）工作溶液CPT-11的浓度分别为62.5、625和5000ng·mL-1,SN-38的浓度为12.5、125和1000ng·mL-1,SN-38G为25、250和2000ng·mL-1。内标伏立康唑工作液的浓度为50ng·mL-1。以上所有溶液均置于-20℃保存。

2.4血浆样品前处理

取血浆样品100μL，加入10μL伏立康唑内标溶液（50ng·mL-1），涡旋振荡30s，加入300μL含0.1%(v/v）甲酸的甲醇，充分涡旋3min后，13000r·min-1离心10min(4℃）。取上清液用于进样分析。

2.5样本采集

伊立替康静脉滴注后1.5h和24h采集患者全血于EDTA抗凝的真空采血管中，以5000r·min-1离心5min后立即分离血浆，测定药物峰、谷浓度[9]。

3、结果

3.1方法学验证

3.1.1专属性

通过对来自6个不同健康个体和消化道肿瘤患者空白血浆与定量限标添样品进行比较以考察方法的专属性。CPT-11、SN-38、SN-38G及其内标伏立康唑的保留时间分别为3.90、4.93、4.25和5.43min，空白血浆中干扰组分的响应均低于定量限响应的20%。在部分患者实测样品SN-38和SN-38G通道的色谱图中，分别在4.00和3.90min处观察到出峰，但并未出现在QC样品的色谱图中，推测可能为人体病理状态中的其他代谢产物，这些峰与目标化合物的峰有良好的分离，不干扰待测物的准确定量，如图2所示。在各化合物的MRM通道间没有观察到串扰现象。

图2CPT-11、SN-38、SN-38G及内标伏立康唑的典型图谱

3.1.2定量下限和线性关系

CPT-11、SN-38和SN-38G浓度分别在2.5～625、0.5～125和1.0～250ng·mL-1内与峰面积线性关系良好。CPT-11的标准曲线方程为y=1.288×10-2x+5.910×10-3(r2=0.993);SN-38的标准曲线方程为y=2.410×10-2x+1.050×10-3(r2=0.998);SN-38G的标准曲线方程y=1.906×10-2x-7.604×10-4(r2=0.998）。选择1/χ2作为权重因子拟合标准曲线。CPT-11、SN-38和SN-38G定量下限分别为2.5、0.5和1.0ng·mL-1，可覆盖临床中消除阶段的定量，且满足信噪比（S/N）≥5的要求。

3.1.3精密度和准确度

CPT-11、SN-38和SN-38G的日内和日间精密度和准确度通过3d内分别进样3个不同批次的定量下限及低、中、高浓度QC样品（n=5）来考察。精密度均以相对标准偏差（RSD）表示，准确度则通过QC样品代入标准曲线计算的理论浓度与实际浓度之间的相对误差（RE）来表示。所有化合物的RE在86.54%～106.31%。日内RSD≤5.0%，日间RSD≤9.7%，均符合方法学验证的要求，可确保在测定实际样品时可靠。

3.1.4样品稳定性

考察了CPT-11、SN-38和SN-38G低、中、高3个浓度水平QC样品（n=5）的稳定性，包括短期室温放置、长期冻存、冻融循环和自动进样器稳定性，以覆盖样品存储和处理以及LC-MS/MS分析中的各种情况。含各分析物的血浆样品室温下放置2h均稳定，RE在86.59%～104.63%；处理后的样品在自动进样器中放置24h稳定，RE在90.35%～109.60%；样品经3个冻融循环（-40℃）后稳定，RE在87.81%～114.53%,RSD均<7.1%。人血浆中的CPT-11,SN-38经-40℃条件下储存30d后均稳定，RE在87.41%～113.64%,RSD<6.3%;SN-38G在-40℃下保存15d内稳定，RE在87.04%～92.67%,RSD<4.2%。稳定性结果提示，应在15d内对患者的血浆进行分析，以避免SN-38G降解的影响。

3.1.5提取回收率、基质效应与稀释效应

用低、中、高3个浓度水平的QC样品（n=3）与各化合物相应浓度的溶剂配制的混合标准溶液比较，测定每种分析物及其内标的提取回收率，结果CPT-11的回收率范围为78.78%～86.15%,SN-38为92.01%～98.10%,SN-38G为74.35%～76.01%。

将低、高浓度QC样品的混合溶液加标到6批不同来源的的蛋白沉淀后的空白血浆中（n=3），并将其峰面积与相应的溶剂配制的混合标准溶液进行比较，比值即为基质因子（MF）。CPT-11、SN-38和SN-38G的MF均在97.14%～105.15%，内标伏立康唑的MF为104.56%,6批血浆间的RSD<14.0%，可说明不同血浆之间无明显差异，不会影响测定结果。

根据已报道的药代动力学研究[7,10]，部分CPT-11实测血样可能需要稀释，且稀释5倍可以覆盖超线性范围以外样品。因此配制超定量上限的高浓度CPT-11样品，并用空白血浆稀释5倍至HQC水平，代入标准曲线回算。平均RE为110.59%,RSD均小于8.4%，表明通过空白血浆稀释高浓度样品不影响测定结果。

3.2临床应用

共收集本院肿瘤科14例使用伊立替康化疗的胃肠道肿瘤住院患者血样，其中男性11名，女性3名，年龄在47～73岁，平均年龄为63岁。患者的基本信息、用药剂量及血药浓度情况见表2。

CPT-11及其两个主要代谢产物浓度个体化差异大，1.5h时，CPT-11、SN-38、SN-38G的平均浓度分别为（551.94±286.23）、（22.51±13.80）、（66.18±53.87)ng·mL-1;24h时，CPT-11、SN-38、SN-38G的平均浓度分别为（30.57±14.63）、（4.96±2.65）、（18.83±16.33)ng·mL-1。

4、讨论

4.1流动相和内标物的选择

由于CPT-11、SN-38和SN-38G均带有碱性官能团，易电离形成[M+H]+，因此选用正离子电离模式。CPT-11可在内酯和羧酸酯形式之间相互可逆转化，且具有pH依赖性，当pH为3～5时，CPT-11可完全转化为稳定的内酯形式；而当pH≥8时，羧酸盐形式则占主导地位[11,12]。因此在流动相中添加一定量的酸可使CPT-11保持其稳定的内酯形式，而且可增加离子化的效率从而有效提高整体灵敏度。分别考察流动相水相中甲酸含量为0.05%、0.1%和0.2%时对出峰的影响，甲酸含量为0.1%和0.2%时，各待测物峰面积响应最大，但0.1%甲酸可以获得最佳峰形和重现性。同样，在作为蛋白沉淀剂的甲醇中也加入0.1%甲酸，使平衡向内酯环形成的方向移动，有利于方法的稳定性和重现性。与已报道的LC-MS/MS方法相比[13,14]，本文所建立的分析方法分析时间短，所用血浆量少，定量限更低，且不需要使用同位素标记的内标，因此在临床TDM中更有优势。由于在患者的化疗中很少联合使用抗真菌药，且伏立康唑在该液相条件下具有适当的保留时间和响应值，且不对其他待测物的信号造成影响，因此本文选择伏立康唑作为内标。本文建立的基于LC-MS/MS测定人血浆中伊立替康及其主要代谢产物SN-38和SN-38G浓度的分析方法专属性强，简便快速，准确可靠，且符合生物样品中药物定量分析方法验证的基本要求，可用于TDM。

4.2CPT-11及其代谢产物浓度与不良反应的关系

将该方法应用于使用伊立替康化疗的消化道肿瘤患者的TDM，通过结合患者临床实际情况，为个体化化疗提供参考。由于对癌症患者多次取血困难，文中选择采集CPT-11静脉滴注后1.5h和24h的血样分别测定峰、谷浓度以反映CPT-11及其代谢产物的暴露和消除情况。相关研究表明，SN-38峰浓度与无病生存期[15]及迟发型腹泻的发生[16]有关，浓度越高时发生中性粒细胞减少越严重[17]；且1.5h与24h的血药浓度能够代替总AUC值预测CPT-11与SN-38的体内药代动力学情况[18]。本文中，患者个体间CPT-11及其代谢产物的浓度差异较大，可达到5～15倍，造成这种差异的原因可能与遗传、肝肾功能、年龄等有关[19]。14名患者中有3名分别发生Ⅲ度以上粒细胞缺乏和Ⅲ度腹泻，1.5h时的CPT-11和SN-38浓度高于无不良反应患者的平均浓度，24h的SN-38G浓度则低于平均值，提示可能是SN-38在体内蓄积导致的不良反应，其进一步的关联性需要后续扩大样本量继续研究。

4.3SN-38G/SN-38与不良反应的关系

SN-38的体内解毒过程是通过肝脏UGT1A1形成SN-38G排出，而一部分的SN-38G会在肠道菌的代谢物作用下重新生成SN-38，这可能也是诱发肠道不良反应的原因，因此测定SN-38G的浓度和SN-38G/SN-38的浓度比值可以更清楚地表明CPT-11和SN-38在体内的代谢消除情况，同时也可以排除不同给药剂量的影响，从而作为调整剂量的依据之一[15]。有研究发现SN-38G/SN-38值的降低与中性粒细胞减少及迟发型腹泻的发生相关，且当比值<3时，在下一轮治疗时可以考虑CPT-11减量30%[5]。3名发生严重不良反应的患者，其1.5h时SN-38G/SN-38的值均小于3，提示SN-38在体内清除受阻，下一程化疗时可以相应下调剂量。SN-38G/SN-38的预测能力将在之后的研究中继续被评估，从而作为调整剂量的依据之一，通过结合患者实际病理生理情况协助临床调整化疗方案，尽可能地避免或减轻不良反应。

表214名消化道肿瘤患者诊疗信息及CPT-11、SN-38、SN-38G的血药浓度

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基金:上海市卫计委重要薄弱学科建设项目——临床药学(No.2016ZB0302);上海交通大学-医工交叉基金项目(No.YG2016QN30).