首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 药学论文 > 药物分析论文 > 灵芝多糖联合二甲双胍应用于2型糖尿病大鼠对炎症因子及胸主动脉血管细胞黏附分子-1表达的影响

灵芝多糖联合二甲双胍应用于2型糖尿病大鼠对炎症因子及胸主动脉血管细胞黏附分子-1表达的影响

2020-06-22 196 上传者：管理员

摘要：目的：探讨灵芝多糖联合二甲双胍对2型糖尿病大鼠炎症因子及胸主动脉血管黏附分子-1(VCAM-1)表达的影响。方法：SD大鼠高脂饮食4周后腹腔注射链脲佐菌素(STZ)30mg•kg-1建立2型糖尿病(T2DM)大鼠模型,随机分成糖尿病组、灵芝多糖组(600mg•kg-1)、二甲双胍组(600mg•kg-1)及联合用药组(灵芝多糖300mg•kg-1+二甲双胍300mg•kg-1),另设正常对照组,每组10只大鼠。灌胃给药,每日1次,正常对照组和糖尿病组给予生理盐水。12周末颈动脉取血,测定血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)及C反应蛋白(CRP),免疫组化法检测主动脉VCAM-1的表达。结果：联合用药组能显著降低血清LDL-C、IL-6、TNF-α、CRP及升高HDL-C水平,并对主动脉VCAM-1表达有明显抑制作用。结论：灵芝多糖联合二甲双胍对预防糖尿病大鼠动脉粥样硬化形成具有协同作用,其机制可能与调节血脂、抗炎作用及抑制VCAM-1的表达有关。

关键词：
二甲双胍
动脉粥样硬化
灵芝多糖
糖尿病大鼠
药物分析
血管细胞黏附分子-1
加入收藏

随着糖尿病的发病率迅速增长，其心血管并发症已成为影响全球公众健康的常见病。动脉粥样硬化病变的加速发展是糖尿病致死和致残的主要原因之一[1]。灵芝多糖是一种杂多糖，它是从多孔菌科真菌灵芝中提取出的，主链为β（1→3）糖苷键[2]。有学者研究发现灵芝多糖可预防大鼠AS病变的形成[3]。英国糖尿病前瞻性研究（UKPDS）证实，二甲双胍是目前唯一能减少糖尿病大血管并发症的口服降糖药，其作用机制可能是降低血清纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1）与C-反应蛋白（CRP）水平，减少氧化应激，改善内皮功能，从而延缓AS病变的进程[4]。灵芝多糖联合二甲双胍预防糖尿病AS病变的报道及两药对糖尿病AS病变的预防是否具有协同作用尚不清楚。笔者已研究灵芝多糖联合二甲双胍通过下调主动脉VEGF的表达、抑制主动脉氧化应激及调节血脂对2型糖尿病大鼠主动脉病变有预防作用[5]，本研究在前期研究的基础上建立2型糖尿病大鼠模型，通过测定低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、血清白介素-6(IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、CRP及血管黏附分子-1(VCAM-1）的表达，进一步阐明其对2型糖尿病大鼠主动脉病变的预防作用，为其临床应用提供参考。

1、材料

1.1实验动物

SD大鼠，雄性，体重180～200g[南通大学动物中心，动物生产许可证号：SCXK（苏）2014-0001，动物使用许可证号：SYXK（苏）2017-0031]。

1.2试药

灵芝多糖（江苏安惠生物科技有限公司，纯度：74.03%，批号：100601）；二甲双胍（上海信谊天平药业有限公司，批号：67100507）；链脲佐菌素（STZ,Sigma公司，临用前用0.1mol·L-1的柠檬酸缓冲液配成浓度为1%的STZ溶液）；IL-6、TNF-αELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；免疫组化EliVisionTMplus广谱试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）；7170A全自动生化分析仪（日本日立公司）；BH-NIC-B型倒置显微镜（日本Olympus公司）。

2、方法

2.1动物分组与给药

80只SD大鼠分笼喂养，分为正常对照组和待造模组。正常对照组10只，给予普通饲料喂养。70只待造模组大鼠先给予高脂饮食（脂肪20%、奶粉5%、蛋黄粉5%、基础饲料70%),4周后禁食12～14h，给予STZ30mg·kg-1腹腔注射。1周后，测得大鼠的空腹血糖≥11.1mmol·L-1即提示造模成功，之后继续给予高脂饲料喂养。将造模成功的40只大鼠随机分为4组：糖尿病组，灵芝多糖组（600mg·kg-1），二甲双胍组（600mg·kg-1），联合用药组（灵芝多糖300mg·kg-1+二甲双胍300mg·kg-1）。正常对照组和糖尿病组大鼠予生理盐水灌胃，与实验组灌胃时间保持一致，连续给药12周。

2.2观察指标

2.2.1血脂与炎症因子检测

给药12周后，大鼠颈动脉插管取血，2500r·min-1分离血清，使用7170A全自动生化分析仪测定血清中LDL-C、HDL-C及CRP水平。ELISA法测定IL-6、TNF-α水平。

2.2.2免疫组化检测主动脉VCAM-1的表达

取各组大鼠的胸主动脉，采用多聚甲醛固定，石蜡包埋与切片。按照免疫组化试剂盒说明书操作，检测大鼠胸主动脉VCAM-1的含量。采用免疫组化法检测胸主动脉中VCAM-1的含量，具体操作按试剂盒说明书进行。将胸主动脉切片置于高倍镜下（×200）每张切片随机选取8～10个视野，细胞膜与胞浆内棕黄色的颗粒即为本研究的阳性信号。采用JEDA801D型形态学图像分析软件测定阳性信号所占面积及平均灰度，两者乘积（即积分光密度值）越大表明组织中VCAM-1含量越高。

2.3统计学分析

采用Stata7.0统计软件分析处理数据，计量资料以均数±标准差表示，比较采用单因素方差分析，q检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

3、结果

3.1大鼠空腹血糖

糖尿病组大鼠的空腹血糖值显著高于正常对照组大鼠（P<0.01）。各用药组大鼠的空腹血糖水平均低于糖尿病组大鼠（P<0.01,P<0.05），且联合用药组大鼠的血糖较单独用药组低（P<0.05），具体见表1。

表1各组大鼠血糖水平

3.2各组大鼠血脂水平

给药12周后，与正常对照组相比，糖尿病组大鼠血清LDL-C含量显著升高（P<0.01），血清HDL-C含量显著降低（P<0.01）。与糖尿病组比较，各治疗组大鼠血清LDL-C水平明显下降（P<0.05,P<0.01），血清HDL-C含量明显升高（P<0.05,P<0.01）。与单独用药组相比，联合用药组大鼠血清LDL-C水平明显下降（P<0.05），血清HDL-C含量明显升高（P<0.05）。具体见表2。

表2各组大鼠血清LDL-C和HDL-C水平

3.3各组大鼠炎症相关因子水平

给药12周后，与正常对照组相比，糖尿病组大鼠血清IL-6、TNF-α、CRP水平明显升高（P<0.01）。与糖尿病组比较，各治疗组大鼠血清IL-6、TNF-α、CRP水平明显降低（P<0.05）。与单独用药组相比，联合用药组大鼠血清IL-6、TNF-α、CRP水平明显降低（P<0.05）。具体见表3。

表3各组大鼠血清IL-6、TNF-α和CRP水平

3.4免疫组化检测大鼠胸主动脉VCAM-1表达

免疫组化图中褐色区域为目标蛋白。与正常对照组相比，糖尿病组大鼠主动脉VCAM-1表达明显增强（P<0.01）。与糖尿病组相比，3个治疗组VCAM-1的表达显著降低（P<0.05,P<0.01），其中联合用药组蛋白表达最低（P<0.01）。见图1及表4。

图1各组大鼠胸主动脉免疫组化图（200×）

表4各组大鼠胸主动脉VCAM-1免疫组化积分光密度值

4、讨论

在临床上，糖尿病患者的并发症中以血管病变最为常见，属于糖尿病的慢性并发症之一，除了严重影响糖尿病患者的生活质量，也是导致其死亡的主要原因。与普通人群相比，糖尿病患者的AS发病率要高45%左右[6]。关于AS发生发展的特点，医学界普遍认可的说法是“损伤反应学说”，认为慢性炎症与血脂代谢紊乱是AS发生发展的主要因素[7]。

人体中脂质代谢紊乱与脂蛋白异常是AS发病的两大因素。血浆中LDL-C与HDL-C的作用相反，过高的LDL-C能促进AS的形成，而高水平的HDL-C则可降低AS发生的风险。学者研究现HDL-C具有重要的抗AS作用，其通过促进胆固醇转运、改善血管内皮功能等多种作用机制发挥抗AS作用[8]。本研究通过高脂饮食+腹腔注射小剂量STZ建立2型糖尿病大鼠模型，联合用药组大鼠血清LDL-C水平显著降低，血清HDL-C水平显著升高，对脂质代谢失调有明显的改善和调节作用，并且疗效优于单独用药组（P<0.05），提示联合用药也是通过调节血脂异常从而预防AS病变的发生，并且疗效优于各单独用药组。

除了脂质代谢紊乱与脂蛋白异常这两个因素外，炎症在AS的发生发展过程中起到关键作用，在炎症的反应过程中，组织会分泌多种炎性介质，这些炎性介质在内皮细胞、淋巴细胞与巨噬细胞之间的黏附对血栓的形成起着重要的作用。TNF-α是目前研究认为明确参与AS的形成、演变和破裂的炎性指标[9]。IL-6可通过细胞信号转导激活NF-κB，从而使得炎症介质和细胞因子的基因转录增强，进一步促使中膜的平滑肌细胞（SMC）向内膜下迁移、增殖转化，导致更多的炎症介质释放，这种信号转导的级联反应使最初的炎症信号不断放大，更多的单核细胞聚集、浸润，导致AS病变加速发展[10]。CRP是与AS关系最密切的炎症因子之一，在AS发展的进程中，CRP在病变局部沉积，增强了白细胞的氧化应激反应，导致白细胞黏附，进一步促进了IL-6的分泌[11]。本研究中联合用药组血清TNF-α、IL-6及CRP水平显著降低（P<0.05），效果优于各单独用药组（P<0.05），提示联合用药在抑制AS发展中的炎症因子的效果优于同等剂量的单独用药组。

内皮细胞表达细胞黏附分子VCAM-1可促进炎性细胞的迁移与浸润，尤其是可以促进单核细胞的迁移与浸润，之后可导致大量的单核细胞进入内皮下成为泡沫细胞，导致AS的发生[12]。VCAM-1主要介导炎症细胞与血管内皮的黏附，因此，降低VCAM-1的表达，是目前抗AS病变治疗的途径之一[13]。本研究结果显示，糖尿病大鼠血清LDL-C、IL-6、TNF-α、CRP水平升高，HDL-C水平降低，提示血管病变，同时糖尿病大鼠VCAM-1蛋白表达上调，除了证实VCAM-1过度表达是导致糖尿病血管AS的因素，还提示联合用药治疗的大鼠主动脉VCAM-1的表达较各单独用药组显著下降（P<0.05）。

综上，本研究中，通过灵芝多糖与二甲双胍的联合干预2型糖尿病大鼠，可降低其AS病变发生的风险，其机制与调节血脂水平、抑制炎症因子的产生与降低VCAM-1的表达有关，联合用药效果优于单独用药，可认为在总剂量不变的情况下，两者合用具有一定的协同作用，提示联合使用灵芝多糖和二甲双胍可能会成为今后临床治疗糖尿病心血管疾病AS并发症的一个新的可能。有关VCAM-1的表达是否为糖尿病血管AS病变的决定因素，以及联合用药在临床人体的适宜剂量、可能产生的不良反应在今后的研究中将继续深入探讨。

参考文献：

[1]万招飞,刘小军,薛嘉虹,等.NLRP3炎症小体在糖尿病患者动脉粥样硬化的作用[J].山西医科大学学报,2019,50(10):1399-1402.

[3]杨燕燕,谢金东,周建华,等.灵芝多糖对ApoE动脉粥样硬化小鼠TLR4/NF-κB信号通路的影响[J].中国中医基础医学杂志,2019,25(1):56-59,67.

[4]杨长卫,马鹏飞,张建祥.二甲双胍对2型糖尿病大血管病变的防治研究进展[J].临床误诊误治,2014,27(1):107-111.

[5]乔进,窦志华,吴锋,等.灵芝多糖联合二甲双胍预防糖尿病大鼠主动脉病变及对VEGF表达的影响[J].中国药理学通报,2014,30(8):1079-1084.

[6]张冰冰,朱爱松,石岩.从Toll受体3介导的信号传导通路探讨中药益糖康对糖尿病小鼠动脉粥样硬化的影响[J].中华中医药杂志,2019,34(10):4885-4888.

[7]赵洁,臧欢欢,成明,等.血清C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白9与2型糖尿病及颈动脉粥样硬化的相关性研究[J].中国糖尿病杂志,2019,27(9):666-670.

[8]陈江君,姜雯雯,陈军,等.瑞舒伐他汀钙对脑梗死合并颈动脉粥样硬化老年患者血管内皮舒张功能与颈动脉硬化､超敏C反应蛋白水平的影响[J].中国医院药学杂志,2019,39(12):1278-1281.

[9]王志超,张弛,张燕,等.糖尿病患者低密度脂蛋白通过激活caspase-12途径诱导小鼠巨噬细胞凋亡[J].中国病理生理杂志,2019,35(6):1016-1022.

乔进,施凯,陈惠,郑惠华,徐济良.灵芝多糖联合二甲双胍对2型糖尿病大鼠炎症因子及胸主动脉血管细胞黏附分子-1表达的影响[J].中南药学,2020,18(06):978-981.

基金:“十一五”国家科技支撑计划子课题项目(No.2006DAI06A20-02);南通市临床医学中心项目(No.HS2016002).