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建立高效液相色谱法测定卤米松原料药中的有关物质

2020-06-22 194 上传者：管理员

摘要：目的：建立高效液相色谱法测定卤米松原料药中的有关物质。方法：以PhenomenexC18(4.6mm×250mm,5μm)为色谱柱,以乙腈-水-冰醋酸(43∶57∶0.1)为流动相,流速为1.0mL•min-1,检测波长为235nm,柱温为30℃。结果：已知杂质和主成分及其他未知杂质均能有效分离,各杂质的线性相关系数均大于0.997,平均回收率在90%～110%。以卤米松为参比,双氟美松、卤米松A、卤米松C的校正因子分别为0.6、0.7、1.1。结论：该方法专属性强,简便可靠,可用于卤米松原料药有关物质的检查。

关键词：
卤米松
原料药
有关物质
药物分析
高效液相色谱法
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卤米松（halometasone，见图1）分子式为C22H27ClF2O5，分子量为444.9，为白色或类白色的结晶性粉末，是一种强效的外用糖皮质激素类药物，具有抗炎、抗过敏、抗增生、收缩毛细血管和止痒的作用，其主要剂型为乳膏剂，在临床上主要用于皮炎、湿疹、白癜风、银屑病和扁平苔藓等多种非感染性炎症性皮肤病的治疗，其使用方便、起效迅速，临床效果得到广泛的认可[1,2,3,4]。在合成的卤米松原料药中可能含有多种杂质如双氟美松、卤米松A、卤米松C（见图1），目前关于这些杂质的分析报道不多。HPLC常用于原料药中杂质的分析[5,6,7,8]，本试验参考了《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》《化学药物杂质研究技术指导原则》以及2015年版《中国药典》附录中有关的指导原则建立了卤米松原料中有关物质检查方法[9,10,11]，以此法检查自制原料药卤米松中的有关物质，为此药物后续的储存及剂型的开发提供质量评价的依据。

图1卤米松（a）、双氟美松（b）、卤米松A(c）和卤米松C(d）的化学结构式

1、材料

1.1仪器

SQP十万分之一电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；SHIMADZULC-20A岛津高效液相色谱仪[岛津仪器（苏州）有限公司]；KQ-400DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SartoriusPB-21PH计[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

1.2试药

卤米松原料药（批号：121101、121102、121103，纯度：99.8%，自制）；卤米松对照品（批号：21-EBS-108-1，纯度：99.6%,TRC）；双氟美松起始原料（纯度：99.4%，武汉远成共创科技有限公司）；卤米松A工作对照品（纯度：98.5%，自制）；卤米松B中间体（纯度：53.6%，含卤米松C40.6%，自制）；卤米松C工作对照品（纯度：98.3%，自制）；乙腈（色谱纯，TEDIA）、冰醋酸（色谱纯）、盐酸（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、30%过氧化氢（分析纯）（国药集团化学试剂有限公司）；注射用水（自制）。

2、方法

2.1色谱条件

色谱柱为PhenomenexC18(4.6mm×250mm,5μm）；流动相为乙腈-水-冰醋酸（43∶57∶0.1）；流速为1.0mL·min-1；检测波长为235nm；柱温为30℃；进样量为20μL。

2.2溶液配制

2.2.1供试品溶液

取卤米松原料药10mg，精密称定，置于50mL量瓶中，加流动相适量溶解，并定容至刻度，摇匀，制成每1mL约含卤米松0.2mg的溶液作为供试品溶液。

2.2.2自身对照品溶液

精密量取供试品溶液1mL，置于100mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液。

2.2.3空白溶液

以流动相作为空白溶液。

2.2.4对照品溶液

分别取双氟美松、卤米松A、卤米松B、卤米松C和卤米松对照品10mg，精密称定，各置于50mL量瓶中，加流动相适量溶解，并定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.5系统适用性溶液

取“2.2.4”项下各对照品溶液，分别精密量取2mL，混合均匀，作为系统适用性溶液。

2.3专属性试验

2.3.1系统适用性试验

取“2.2”项下各溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，见图2，双氟美松、卤米松、卤米松A、卤米松C、卤米松B依次出峰，分离度符合要求，卤米松理论塔板数不低于3000，系统适应性良好。

图2系统适用性试验色谱图

2.3.2破坏性试验

(1)未破坏：按“2.2.1”项下方法配制未破坏溶液。

(2)酸破坏：取本品10mg，精密称定，置50mL量瓶中，用少量流动相溶解后，加入1mol·L-1的盐酸溶液3mL破坏4h，加入等量的1mol·L-1的氢氧化钠溶液中和后，加流动相定容至刻度；同法配制酸空白溶液（扣除本身的溶剂峰）。

(3)碱破坏：取本品10mg，精密称定，置50mL量瓶中，用少量流动相溶解后，加入1mol·L-1的氢氧化钠溶液3mL破坏4h，加入等量1mol·L-1的盐酸溶液中和，加流动相定容至刻度；同法配制碱空白溶液。

(4)氧化破坏：取本品10mg，精密称定，置50mL量瓶中，用少量流动相溶解，加30%双氧水1mL破坏4h，加流动相定容至刻度；同法配制氧化空白溶液。

(5)光照破坏溶液：取本品于表面皿上，均匀分布高度约5～10mm，置日光灯（4500Lx）下照射24h，按“2.2.1”项下方法配制溶液。

(6)高温破坏溶液：取本品置沸水浴加热4h，按“2.2.1”项下方法配制溶液。

取上述各溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，见图3。试验表明在此色谱条件下，本品在光照、高温、氧化条件下相对稳定，无明显的降解杂质，在碱破坏条件下降解最为突出；各杂质峰与主成分峰分离良好，经DAD验证各峰的峰纯度均符合要求，未检出不纯物，该色谱条件下可进行本品有关物质的检查。

2.4线性关系试验

按“2.2”项下方法配制双氟美松、卤米松对照溶液，取双氟美松对照液稀释100倍，作为储备溶液A；取卤米松对照液稀释10倍，作为储备液B；分别精密量取储备液A2.5、4.0、5.0、6.0、10.0mL至50mL量瓶中，再分别精密量取储备液B0.5、2.5、5.0、7.5、10.0mL至上一对应50mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为双氟美松系列浓度溶液；同法配制卤米松A、卤米松C系列浓度溶液。取各系列浓度溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。以浓度（µg·mL-1）为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制回归曲线，计算回归系数，结果见表1。

表1线性关系考察(n=5)

图3样品破坏性试验色谱图

2.5校正因子的测定

根据“2.4”项下结果，在各组分线性范围内，以各自浓度与峰面积的比值，计算杂质相对卤米松的校正因子，双氟美松、卤米松A、卤米松C的校正因子的平均值分别为0.6、0.7、1.1。

2.6定量限和检测限

取“2.4”项下线性关系试验溶液分别逐级稀释，按“2.1”项下色谱条件进样，以信噪比（S/N)=3为检测限，以S/N=10为定量限，结果卤米松、双氟美松、卤米松A、卤米松C的定量限分别是3.98、2.04、1.97、1.91ng；检测量限分别是1.99、1.02、0.98、0.96ng。

2.7稳定性试验

取“2.2”项下对照品溶液，于0、4.5、6、7.5、10、24h按“2.1”项下色谱条件分别进样；另取供试品溶液，于0、2、4、6、8、24h分别进样测定，结果各组峰面积的RSD均小于2%[12]，表明各杂质对照溶液与有关物质测定溶液在24h内相对稳定。

2.8精密度试验

2.8.1重复性试验

按“2.2”项下方法配制供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件进样，结果显示杂质双氟美松的RSD为2.6%，卤米松A未检出，卤米松C低于定量限，最大未知单杂的RSD为3.0%，总杂质RSD为2.9%，表明本方法的重复性较好。

2.8.2中间精密度试验

由不同操作人员，在不同时间和不同仪器分别按“2.8.1”项下操作进行试验，计算中间精密度。结果杂质双氟美松的RSD为5.0%，卤米松A未检出，卤米松C低于定量限，最大未知单杂的RSD为5.1%，总杂质RSD为5.6%，试验结果表明本方法的中间精密度较好。

2.9杂质回收试验

取双氟美松、卤米松A、卤米松C适量按有关物质限度的80%、100%、120%混合，再分别称取卤米松原料药适量加入，加流动相溶解并定量稀释制成每1mL中约含卤米松0.2mg的溶液（本底）。按“2.1”项色谱条件进样，计算回收率，结果各已知杂质回收率均在90%～110%，偏差（RE）小于10%，说明该方法的准确度较好。

2.10耐用性试验

取双氟美松、卤米松A、卤米松B、卤米松C、卤米松适量，加流动相溶解，并制成每1mL约含双氟美松、卤米松A、卤米松B、卤米松C20μg和卤米松0.2mg的溶液，作为耐用性试验溶液的分析对象，对流动相比例、流速、流动相pH值、柱温、波长、不同色谱柱进行适当调整，考察方法的耐用性。结果表明主峰和各杂质峰均能达到良好的分离效果，本色谱条件耐用性较好，试验结果见表2。

2.11有关物质的检查

照“2.1”项下方法，对本品3批样品进行有关物质的测定，按“2.2”项下方法配制供试品溶液、自身对照溶液、空白溶液。精密量取自身对照溶液20μL，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%～25%。再精密量取供试品溶液、自身对照溶液、空白溶液各20μL进样测定，计算各杂质的含量、其他单个杂质的含量和杂质总量。结果多批样品的单个杂质均小于0.1%，总杂质均小于0.2%。样品的有关物质检查均符合规定，见表3。

表2耐用性试验结果汇总

表3样品有关物质测定结果(%)

3、讨论

本试验流动相的选择在参考了相关文献[13]的基础上，通过调整各成分的比例，最后确定选用乙腈-水-冰醋酸（43∶57∶0.1）作为流动相，能较好的分离卤米松中的主峰与杂质峰。

卤米松在200～400nm进行扫描检测，选择最佳吸收波长。发现其最大吸收波长为245nm，而在235nm与250nm波长下检出杂质个数最多，且235nm波长下杂质的响应值较大，因此初步确定235nm为有关物质检查的波长。

在卤米松有关物质研究早期相关资料中，色谱条件为等度，目前的研究中也有文献报道[14]有关物质的检查采用梯度洗脱，本试验色谱条件为等度洗脱，时间与梯度洗脱方法相比未见明显差异，此洗脱方法对本试验的仪器及系统的耐用性较好，是否有更好的梯度洗脱法还需要进一步的摸索和研究。

强制降解试验主要是提供关于杂质或降解产物与主成分的分离、样品的稳定性等情况，在本试验中各破坏条件下主成分保留时间的3.5倍之后无降解杂质出现，因此拟定在该色谱条件下检查本品的有关物质，记录运行时间至主成份保留时间的4倍即可。卤米松B中间体不纯，其中含有部分卤米松C，在原料药卤米松合成过程中卤米松B会转变为卤米松C，所以在进行有关物质方法学的验证中一些试验项目中不加卤米松B进行试验。

本试验测定了3批样品的有关物质，卤米松A和卤米松C均未检出，双氟美松的含量小于0.05%，未知杂质中最大单个杂质的含量均小于0.1%，总杂质的含量均小于0.2%，符合企业制定的质量标准，即双氟美松、卤米松A、卤米松C、其他单个杂质均不得大于0.1%，总杂质不得大于0.5%。

综上所述，本试验确定的色谱方法经验证，其专属性较强，能完全有效地分离样品中的有关物质，可用于控制自制卤米松原料药的质量。

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