他克莫司作为肾移植术后患者常用的免疫抑制剂，可降低器官排斥反应的发生，提高患者的生存率和生活质量。TAC代谢个体差异大，其中药物相互作用和遗传因素为重要因素。TAC主要经P450酶代谢，与肝药酶抑制剂或诱导剂联用时可能会使其血药浓度明显改变[1]。CYP3A5基因表达型（CYP3A5*1/*1和*1/*3）患者需要更高剂量的TAC才能达到CYP3A5基因非表达型（CYP3A5*3/*3）患者相近的血药浓度[2,3]。在一些研究中发现CYP3A4*18B基因型与TAC的血药浓度显著相关[4,5]。此外，POR*28基因型也被认为可能与TAC剂量上调有关[6]。由于TAC个体差异大且治疗窗窄，需进行治疗药物监测（TDM），根据患者不同特征进行个体化给药。群体药代动力学（PPK）模型可以定量分析群体中对于药物浓度有影响的因素，结合不同的计算方法，准确地估算出个体药动学参数[7]，模拟出初始给药剂量以及结合TDM结果确定剂量调整方案，从而使患者快速达到目标浓度，提高TAC用药的安全性和有效性。因此，本研究的目的是通过建立PPK模型研究基因多态性和药物相互作用等多种因素对TAC代谢的影响，为肾移植受者个体化治疗提供依据。

1、材料与方法

1.1患者和数据

本研究收集2015年6月至2019年3月安徽医科大学第一附属医院门诊或住院的肾移植受者218例，其中162例患者的数据用于模型建立（即模型建立组），56例用于模型验证（即模型验证组）。纳入标准：(1)年龄大于18岁的肾移植患者；(2)接受TAC，吗替麦考酚酯和糖皮质激素三联免疫抑制方案；(3)首次接受肾移植术。排除标准：(1)无法获得准确剂量和临床数据信息的患者；(2)有接受其他器官移植的患者；(3)无法获得血液样本的患者。从TDM中获取全血稳态谷浓度数据，在医院电子病历中收集患者在TDM期间的临床信息数据。本研究经安徽医科大学第一附属医院伦理委员会批准（Quick-PJ2019-09-10）。

1.2治疗方案

本研究所有肾移植受者均使用TAC、吗替麦考酚酯和糖皮质激素三联抗排斥方案[8]。TAC胶囊初始剂量为0.1～0.15mg·kg-1，根据谷浓度调整剂量，调整依据为：术后第1个月为10～15ng·mL-1，第2～3个月为8～15ng·mL-1，之后为5～10ng·mL-1；吗替麦考酚酯胶囊（上海罗氏制药有限公司，规格：0.25g)1.0～1.5g·d-1；醋酸泼尼松片（山东新华制药有限公司，规格：5mg)10mg·d-1口服维持。术后预防及治疗真菌感染：伏立康唑（晋城海斯制药有限公司，规格：0.2g/支）0.2gq12hivgtt。部分患者予以红霉素肠溶胶囊（浙江丽水众益药业有限公司，规格：0.25g)0.25gbidpo；五酯胶囊（四川禾正制药有限责任公司，规格：每粒含五味子甲素11.25mg)2粒bidpo。降压药物：地尔硫䓬缓释片（上海延安万象，规格：90mg)90mgqdpo；硝苯地平控释片（上海现代制药有限股份公司，规格：30mg)30mgqdpo；美托洛尔缓释片（阿斯利康制药有限公司，规格：47.5mg)47.5～95mgqdpo。

1.3血药浓度测定

使用酶放大免疫测定技术通过SYVAViva-Emit2000Assay仪器测定TAC全血谷浓度。检测限为2.0ng·mL-1，检测范围为2.0～30ng·mL-1。批内精密度的变异系数（CV）在10%以内，批间精密度的CV在20%以内。浓度高于定量范围的样本通过稀释测定。

1.4基因型检测

使用血液基因组DNA提取试剂盒（柱型）（上海捷瑞生物工程有限公司）从外周全血中提取DNA。采用PCR-RFLP法对CYP3A4*18B(rs2242480）、CYP3A5*3(rs776746）、POR*28(rs1057868）共3个位点进行基因分型，扩增引物见表1。实验条件参考文献[9,10]。

表1引物序列表

1.5群体药代动力学模型

药代动力学模型是通过NONMEM7.4软件以非线性混合效应模型（NONMEM）进行拟合。使用带有子程序ADVAN2TRANS2的一阶条件估计方法来估算药代动力学参数。采用R(3.4.4）软件绘制NPDE图及GOF图。

1.5.1基础模型

由于本研究纳入的血药浓度监测数据均为稀疏稳态谷浓度数据，故采用一级吸收和消除的一室模型建模，固定Ka为3.09h-1[11]，估算分布容积（V）和清除率（CL）的典型值。由于生物利用度（F）无法量化，因此V和CL用表观分布容积（V/F）和表观清除率（CL/F）表示，基础模型的表达式如下：

CL/F=TV(P1）×EXP（η1）（公式1)

V/F=TV(P2）×EXP（η2）（公式2)

式中TV(P1）与TV(P2）代表参数的群体典型值，η1和η2代表参数的个体间变异。

1.5.2统计学模型

统计学模型是描述药代动力学参数个体间变异和残差变异的数学模型，由于药代动力学个体参数值和群体典型值之间呈对数正态关系[12]，因此个体间变异通过指数误差模型描述，公式如下：

Pij=TV(Pj）×eηij（公式3)

式中Pij为某一受试者的PK参数值，TV(Pj）为该参数的群体典型值，η是成正态分布、均数为0、方差为ω2的个体变异。

残差变异指个体间变异以外的变异，即无法解释的变异，包括取样、分析方法和模型等造成的误差。残差模型采用加法、比例及加法比例混合模型，其中混合模型如公式4。残差模型的选择基于最小目标函数值（OFV）和参数相对标准误差（RSE）。

Yij=Fij×（1+ε1ij）+ε2ij（公式4)

上式中Yij为实际观测值，Fij为模型预测值，ε1ij和ε2ij分别为均数为0，方差为σ12和σ22的残差变异。

1.5.3协变量模型

本研究协变量的选择是依据TAC药代动力学理论推导、文献报道以及所有可能的联合用药。考察的连续协变量包括年龄、体重、术后时间、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、γ-谷氨酰转肽酶、碱性磷酸酶、估算的肾小球滤过率、肌酐、红细胞比容（HCT）和白蛋白；分类协变量包括性别、供肾来源（亲属供肾或尸体供肾）、CYP3A5*3、CYP3A4*18B、POR*28基因多态性以及地尔硫䓬、硝苯地平、美托洛尔、红霉素、五酯胶囊和伏立康唑联合用药。

连续型协变量分别用线性（公式5）、指数（公式6）或幂函数（公式7）模型逐一筛选。分类型协变量采用线性模型筛选（公式8和9，以性别为例）。

P=TV(P）×（1+θ*covariate/reference）（公式5)

P=TV(P）×EXP（θ*covariate/reference）（公式6)

P=TV(P）×（covariate/reference）θ（公式7)

IF(Male.EQ.0)P=TV(P）（公式8)

IF(Female.EQ.1)P=TV(P）×（1+θ）（公式9)

式中P为药代动力学参数，P=TV(P）为群体药代动力学参数（P）的典型值，反映该固定效应对参数的影响程度。Covariate为拟筛选的协变量，reference为该固定效应的典型值，Male为男性，Female为女性。

协变量的筛选采用前向纳入和向后排除法对各个协变量进行逐一考察。在向前纳入过程中，当OFV下降值在>3.84(P<0.05,df=1）时认为该参数可作为协变量引入模型，如此反复进行，直至OFV值的变化无统计学意义；然后再采用向后剔除法，每次从模型中剔除一个协变量，当OFV值上升大于10.83(P<0.001,df=1）时确认该参数可作为协变量保留在模型中，否则予以剔除。排除无显著意义的参数后，得到最终模型。

1.6模型验证

1.6.1内部验证

通过拟合优度图（GOF图）来评估模型的拟合度。使用Bootstrap法来验证模型的稳健性：从原始数据中有放回的随机抽样生成1000个数据集，计算每一组数据集PPK参数，通过这些PPK参数的平均值和95%置信区间（CI）和最终模型参数估算值比较来评价模型稳健性。基于蒙特卡洛模拟法1000次模拟的正态化预测分布误差（NPDE）对模型的预测性进行评价。

1.6.2外部验证

在外部验证数据集中，使用均方根误差（RMSE）、平均预测误差（MPE）和标准预测误差（SPE）计算谷浓度观测值与群体预测值之间的精密度和准确度：

（公式）

式中COBS为谷浓度观测值，CIPRED为谷浓度群体预测值，SD为标准差。

2、结果

2.1患者特征

本研究中建模组162例（男性110例，女性52例），年龄范围18～64岁（中位数为35岁），体重范围32～92kg（中位数为60kg),TAC谷浓度点1634个，谷浓度中位数为9.3ng·mL-1；验证组56例患者（男性39例，女性17例），年龄18～65岁（中位数为37岁），体重范围34～99kg（中位数为60kg），共收集602个谷浓度点，中位数为10.4ng·mL-1。验证组未对地尔硫䓬、硝苯地平、美托洛尔用药信息进行统计。患者特征详细信息见表2。所有患者均按照CYP3A5*3、CYP3A4*18B和POR*28多态性成功地进行了基因分型，且基因分型结果均符合HardyWeinberg(P>0.05），具体结果见表3。

表2患者特征总结

表3基因分型结果[n(%)]

2.2基础模型

基础模型CL/F与V/F的估算值分别为13.1L·h-1和648L,CL/F和V/F的个体间变异分别为36.9%、99.9%。混合残差模型的OFV值为6317.1要小于加法型（6685）和比例型（6375），且参数相对标准误差（RSE）均<50%，故选择混合模型描述残差变异性。基础模型的详细参数见表4。

表4基础模型与最终模型参数估计及自举检验结果

2.3协变量模型

在向前纳入步骤中，在CL/F上逐个将红霉素、伏立康唑、五酯胶囊、CYP3A5*3、HCT和AST纳入到基础模型中，OFV值分别下降了30.68、656.3、56.9、67.6、94.2和6.6（△OFV>3.84,P<0.05），其他协变量纳入时△OFV<3.84，故将其排除，而在向后排除过程中分别剔除红霉素、伏立康唑、五酯胶囊、CYP3A5*3、HCT和AST后模型的OFV值上升分别为13.6、821.8、16.5、40.9、17.9和6.6，由于AST未大于10.83(P>0.001），因此将其从模型中移除。在V/F上未纳入任何一个协变量。最终模型保留了红霉素、伏立康唑、五酯胶囊、CYP3A5*3和HCT5个协变量。模型的OFV值从6317.1下降到5323.3，且所有估算参数的RSE均<30%,CL/F的个体间变异下降9.9%，表明协变量的加入改善了模型的性能。最终模型详细数据在表4中。最终模型见公式13。

其中FLKZ、WZ和HMS分别为伏立康唑、五酯胶囊和红霉素。

2.4模型验证

2.4.1内部验证

图1显示观测值与个体预测值、观测值与群体预测值拟合图中，观测值均均匀分布在趋势线的两侧，个体预测值因纳入了个体间变异和残差变异预测误差减小。条件权重残差则均匀分布在零位线上下，且其值绝大部分分布于±2之间，表明模型拟合结果较好[13]。

通过1000次重新采样的Bootstrap获得的参数估计平均值和95%CI结果见表4。最终模型的参数估计值与Bootstrap参数估计均值相近，且最终模型参数估计值均落在Bootstrap法参数估计值95%CI内，说明模型有较好的稳健性。正态化NPDE统计学检验的t检验、Fisher检验和Shapiro-Wilks检验P值分别为0.025,0.848和0.282，调整后P值为0.075，图2中NPDE分布与理论分布分位数图和正态分布直方图显示NPDE值符合正态分布，且NPDE值与时间和群体预测值的散点大部分均匀分布在±2之间，表明该模型具有较好的预测能力。

图1最终模型的GOF图

图2最终模型的NPDE结果

2.4.2外部验证

外部验证在56例患者的602个谷浓度数据集中进行。最终模型的预测值为（11.0±4.6)ng·mL-1，与观测值（11.1±4.5)ng·mL-1相近，两组数据差异无统计学意义（P=0.87）。RMSE为4.63,MPE为0.1,SPE均值为0.35，表明最终模型的精密度和准确度较高。

3、讨论

本研究在肾移植受者中成功建立了一个TAC的PPK模型，并且通过内部和外部验证证明了模型的可靠性和实用性。最终模型的CL/F估算值为24.6L·h-1，与以往研究报道结果相似[14,15],V/F估算值为502L，介于研究报道的205～1070L[16,17]，不同研究中V/F之间的差异可能与研究人群种族、样本量大小、肾移植术后不同阶段、患者特征和群体分析方法相关。最终伏立康唑、红霉素、五酯胶囊、CYP3A5*3和HCT显示与TAC的清除率显著相关。这是红霉素首次作为显著影响TAC代谢的因素被纳入到PPK模型中。

肾移植术后抗排斥治疗时，高血压、感染等合并症及并发症较多，联合用药是临床药物治疗中不可避免的情况。TAC与联合用药的相互作用可能会引起药代动力学改变，从而影响其有效性及安全性。红霉素为大环内酯类抗菌药物，作为一种肝药酶抑制剂，通过与CYP3A4酶结合形成非活性复合物，抑制TAC在肝脏和小肠的代谢，从而提高TAC血药浓度[18]。在肾移植中关于红霉素与TAC相互作用的研究较少，本研究通过PPK模型证实红霉素与TAC代谢显著相关。联用红霉素后TAC的CL/F是单用TAC的0.76倍，这意味着联用红霉素后TAC的剂量应调整为原剂量的3/4。

三唑类抗真菌药伏立康唑在肾移植受者中被用于预防和治疗真菌感染，CYP3A酶是其主要代谢酶之一，与TAC联用时可能会引起TAC代谢减慢，血药浓度升高[19]。本研究中联用伏立康唑后，TAC的CL/F下降0.65倍，这与文献报道结果相似[20]。因此，联用伏立康唑后，TAC剂量应下调为原剂量的0.35倍，与Capone等[21]推荐的减量至1/3相近。

五酯胶囊为国产自主研发的保肝类中成药，在体内可通过抑制CYP3A介导的代谢以及减少胃肠首过效应影响TAC血药浓度[22,23]。研究发现联用五酯胶囊会导致TAC的CL/F降低，与之前研究结果一致[20,22]，联用五酯胶囊后TAC的CL/F下降0.29倍，TAC剂量应下调为原剂量的7/10。

遗传因素是影响TAC代谢的重要因素，本研究分析了3种基因型CYP3A5*3、CYP3A4*18B和POR*28与TAC代谢的关系，最终只有CYP3A5*3有显著相关性。CYP3A5*1/*1和*1/*3基因型患者的TAC的CL/F分别是CYP3A5*3/*3基因型患者的1.97倍和1.66倍，这与Reséndiz-Galván等[24]研究结果相似，不同基因型之间CL/F差异较大，因此TAC剂量应根据基因型进行调整。TAC主要分布在红细胞中，本研究发现，HCT水平与TACCL/F成负相关，当HCT从30%下降到20%,CL/F上升约26%，这与Andrews等[25]的研究结果相似。

此外，本研究还比较了不同基因型下各联合用药对TAC血药浓度的提升作用。根据最终模型公式，在使用相同联合用药时，CYP3A5*1/*1和*1/*3型患者的清除率分别是CYP3A5*3/*3型患者的1.97倍和1.66倍。根据药时曲线下面积=剂量/清除率，在相同TAC剂量下联合用药时，携带CYP3A5*3/*3型患者的浓度升高程度最大，其次是CYP3A5*1/*3，浓度升高最低是CYP3A5*1/*1型患者。Kuypers等[26]在TAC联合酮康唑的研究中CYP3A5*3/*3基因型患者TACC/D值增幅较大。Vanhove等[27]报道TAC联用伏立康唑/泊沙康唑时，与CYP3A5*3/*3基因型患者相比，*1/*1和*1/*3型患者C/D的增加较少。这与本研究红霉素、伏立康唑和五酯胶囊对TAC浓度影响的结果一致。因此，在联用红霉素、伏立康唑或五酯胶囊的患者中，TAC剂量选择应考虑到CYP3A5基因分型对其增效作用的差异。

研究联合用药、基因多态性对TAC的血药浓度影响对临床合理用药有显著指导意义。本研究尽量考察所有联合用药的影响，但是部分联合用药的数量未达到10%，未予以纳入协变量的筛选，如利奈唑胺，这还有待今后纳入更大样本病例进一步研究。

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