肝癌是危害人类健康的重大疾病之一[1,2]。近年来，一种通过磁性纳米粒子发挥作用的磁热疗法受到众多研究学者的关注[3]。MHT通过磁滞机制或交变磁场可以诱导MNPS在肿瘤病灶部位产热，使局部升温至42～46℃，但不损伤周围正常组织[4,5]。纳米氧化石墨烯因独特的二维平面结构使其具有载药量高、生物相容性好及稳定性强的优点[6,7]。在各种功能化的NGO中，经过磁性材料修饰后的NGO即磁性纳米氧化石墨烯（NGO/IONP）已作为磁热疗法的药物载体受到了相应研究[8,9]。

多西紫杉醇（Docetaxel,DTX）属于紫杉烷类抗肿瘤药物，具有较为广泛的抗瘤作用，但其本身水溶性差、毒性大、缺乏肿瘤靶向性[10,11]。甘草次酸（Glycyrrhetinicacid,GA）是传统中药甘草中天然产物甘草酸的三萜苷元成分[12,13]。研究发现，GA具有良好的肝靶向性[14]。鉴于此，本研究以DTX为模型药物，GA修饰的壳聚糖（GA-CS）为主要载体材料，采用离子凝胶化法制备一种同时包裹NGO/IONP、DTX的磁性纳米粒（GA-DTX-NGO/IONP-NPs），并对其进行表征，为肝肿瘤的磁热-化疗联合治疗提供参考。

1、材料

1.1仪器

METTLERAE240型十万分之一天平、DSC1STARE型差式扫描量热（DSC）仪（德国Mettler-Toledo公司）；Nano-ZS90型电位及粒度分析仪（英国Malvern公司）；FD-1A-50型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；Spectrum100型傅里叶变换红外光谱（IR）仪（美国PerkinElmer公司）；JEM-1400型透射电镜（日本JEOL公司）；22331Hamburg小型台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；COS-30A型真空干燥箱（上海施都凯仪器设备有限公司）；T6型新世纪紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；DYNACOOL型振动样品磁测量仪（美国QuantumDesign公司）；MW-GX-808/3000mW型激光器（中国科学院长春激光所）；KQ-500DV型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2药品与试剂

GA原料药（武汉远成共创科技有限公司，批号：405310，纯度：>98%);DTX原料药（上海瀚香生物科技有限公司，批号：C338774，纯度：>98%）；纳米氧化石墨烯（南京吉仓纳米科技有限公司，批号：JC181213);N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、CS（上海瑞永生物科技有限公司，批号：RT19U311、RA2017L712);N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、三聚磷酸钠（天津市致远化学试剂有限公司，批号：2010082022、2017112022);1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl，上海思域化工科技有限公司，批号：HF1160624）；甲醇、丙酮等其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2、方法与结果

2.1NGO/IONP及GA-CS的合成

2.1.1NGO/IONP的合成

采用水热法进行合成。称取NGO20mg，加入乙二醇-二乙二醇（1∶19,V/V）混合溶液20mL，超声（功率：500W，频率：40kHz)30min，再以探头超声（功率：80W，频率：20kHz)5min。依次称取醋酸钠0.3g、FeCl3·6H2O0.108g加入上述溶液中，搅拌溶解混匀，必要时超声（条件同上），然后放置于200℃油浴中搅拌反应10h[15]。反应结束后，以5000r/min离心处理10min，沉淀用无水乙醇和水多次洗涤后，冷冻干燥即得黑色固体NGO/IONP，以此为抗肿瘤药物载体。

2.1.2GA-CS的合成

采用酰胺反应合成GA-CS。称取CS50mg，溶于1%醋酸溶液10mL中，4℃下放置过夜，使其溶解完全。称取GA12.5mg溶于DMF5mL中，加入NHS4.59mg、EDC·HCl7.65mg后冰浴30min，冰浴结束后将此溶液缓慢滴加到CS溶液中，室温下反应6h，然后在80℃下反应48h[16]。反应结束后，加入过量（50mL）丙酮，沉淀6h以纯化除杂，以3000r/min离心5min后弃去上清，沉淀依次用乙醇、乙醚洗涤后，真空干燥即得淡黄色固体GA-CS。

2.2NGO/IONP及GA-CS的表征

2.2.1IR表征

分别将NGO、NGO/IONP以及CS、GA、GA-CS与溴化钾混合后（1∶100,m/m），压片，采用IR法对上述物质结构进行表征，结果见图1、图2。

图1NGO和NGO/IONP的IR图谱

图2CS、GA和GA-CS的IR图谱

由图1可见，与NGO的IR谱图相比，NGO/IONP除了具有NGO的特征峰外，在575cm-1处出现了Fe—O伸缩峰，提示NGO/IONP成功合成。

由图2可见，在CS的IR谱图中，2878cm-1处出现ν（CH2基）伸缩振动吸收峰，1655cm-1处出现的弱吸收峰为未完全脱乙酰度ν（NHCOCH3）的酰胺吸收峰，1596cm-1处出现的为ν（NH2基）弯曲振动吸收峰。在GA的IR谱图中，2947cm-1处出现的为ν（CH2基）伸缩振动吸收峰。在GA-CS的IR谱图中，出现在GA图谱中2934cm-1和CS图谱中2881cm-1处出现的ν（CH2基）伸缩振动吸收峰，1662cm-1处酰胺ν（C=O）峰明显增强，1563cm-1处的ν（NH2基）振动吸收峰减弱，并和酰胺（Ⅱ）峰相重叠成一个较宽的峰，提示GA-CS成功合成。

2.2.2DSC表征

对CS、GA、GA-CS以及GA-CS物理混合物（质量比为1∶1）进行DSC扫描，扫描温度为30～400℃，结果见图3。

由图3可知，CS与GA有各自不同的吸热峰与放热峰，GA-CS物理混合物中具有二者共同的特征峰。而GA-CS与GA-CS物理混合物的峰形完全不同，与CS相比也有所改变，这证明GA-CS成功合成。

2.2.3磁性表征

称取NGO/IONP10mg，加5mL水超声，得到NGO/IONP水分散液。在室温条件下，于振动样品磁测量仪中测定该水分散液的磁滞回线，外加磁场区间为-20000～20000Oe，结果见图4。

图3DSC分析图

图4NGO/IONP的磁滞回线

现象，饱和磁化强度大约为22emu/g。参考前期本课题组建立的IONP的磁滞回线[17]可知，本研究合成的NGO/IONP具有超顺磁性。

2.3GA-DTX-NGO/IONP-NPs的制备

采用离子凝胶化法[18]制备GA-DTX-NGO/IONP-NPs。称取GA-CS10mg，溶于1%醋酸溶液（pH4.5)5mL中，搅拌溶解后得GA-CS的高分子溶液。称取NGO/IONP3mg，分散于GA-CS溶液中，超声处理30min，探头超声（功率：80W，频率：20kHz)5min，制得溶液(1)。称取DTX3mg，溶于0.2mL甲醇中，将DTX药液加入上述溶液(1)中，超声（功率：500W，频率：40kHz)2h，制得溶液(2)。然后在室温下搅拌的同时，将TPP水溶液（1mg/mL）缓慢滴加入溶液(2)中，直至产生淡蓝色乳光时停止滴加，继续搅拌1h，即得GA-DTX-NGO/IONP-NPs。同法制备空白纳米粒（仅不加DTX，其余步骤相同）。

2.4GA-DTX-NGO/IONP-NPs中DTX的含量测定

采用紫外-可见分光光度法测定GA-DTX-NGO/IONP-NPs中DTX的含量。

2.4.1检测波长的确定

称取DTX2.01mg，加甲醇溶解并定容至2mL，得质量浓度为1.005mg/mL的DTX贮备液；取上述贮备液适量，加甲醇稀释，制成质量浓度为20.1μg/mL的DTX供试品溶液。取空白纳米粒适量，加甲醇稀释，得空白纳米粒供试品溶液。以甲醇为空白对照进行调零，分别取上述2种供试品溶液于200～500nm波长范围内进行全波长扫描，结果见图5。

图5紫外-可见吸收光谱图

由图5可知，DTX的最大吸收波长为230nm，空白纳米粒在此波长处基本无吸收，表明空白辅料对DTX测定无干扰，故选择检测波长为230nm。

2.4.2方法学考察

(1）线性关系考察：精密吸取“2.4.1”项下DTX贮备液适量，加甲醇分别稀释制成质量浓度为5.02、10.05、15.07、30.15、40.2μg/mL的对照品溶液，并于230nm波长处测定其吸光度。以DTX质量浓度为横坐标（x，μg/mL）、吸光度为纵坐标（y）进行线性回归，得DTX的回归方程为y=0.025x-0.0432(R2=0.9991）。结果表明，DTX在5.02～40.2μg/mL质量浓度范围内线性关系良好。（2）其他方法学考察：按照2015年版《中国药典》（四部）[19]标准进行精密度、稳定性和加样回收率考察。结果，精密度、稳定性（0、2、4、6、8、12h）、重复性试验的RSD分别为0.81%(n=6）、1.04%(n=6）、0.62%(n=6）；低、中、高（6、20、40μg/mL)3个质量浓度的平均加样回收率分别为99.67%、99.90%、99.89%,RSD分别为0.16%、0.09%、0.04%(n=3）。

2.5GA-DTX-NGO/IONP-NPs的表征

2.5.1形态观察

采用透射电镜法进行观察。吸取“2.3”项下空白纳米粒和GA-DTX-NGO/IONP-NPs2.5mL，分别加水定容至5mL，混匀后，滴至专用的碳膜铜网上，采用磷钨酸染色，待干燥后于透射电镜下观察其形态，结果见图6。

由图6可见，空白纳米粒和GA-DTX-NGO/IONP-NPs的形态良好，粒径均约为200nm。与空白纳米粒相比，GA-DTX-NGO/IONP-NPs呈圆球状，有黑色簇状物吸附在纳米粒内外，笔者推测这可能是由于纳米粒负载了大量DTX-NGO/IONP。

2.5.2粒径及Zeta电位测定

精密吸取“2.3”项下空白纳米粒和GA-DTX-NGO/IONP-NPs各0.5mL，分别加水定容至5mL，混匀后，采用电位及粒度分析仪测定其粒径及Zeta电位的分布，结果见图7、图8。

图6空白纳米粒和GA-DTX-NGO/IONP-NPs的透射电镜图

图7空白纳米粒与GA-DTX-NGO/IONP-NPs的粒径分布

图8空白纳米粒与GA-DTX-NGO/IONP-NPs的Zeta电位分布

结果显示，空白纳米粒的粒径为（226.0±3.6)nm,Zeta电位为（15.1±1.0)mV;GA-DTX-NGO/IONP-NPs的粒径为（262.8±4.2)nm,Zeta电位为（13.6±1.5)mV。由图7、图8可见，空白纳米粒和GA-DTX-NGO/IONP-NPs的粒径和电位分布均较均匀。

2.5.3包封率及载药量测定

采用超滤离心法[20]测定GA-DTX-NGO/IONP-NPs的包封率和载药量。精密吸取“2.3”项下GA-DTX-NGO/IONP-NPs0.2mL，加适量甲醇破乳0.5h，然后再用甲醇定容至5mL，采用紫外-可见分光光度仪于230nm波长处测定溶液吸光度，按照“2.4.2(1）”项下DTX回归方程计算出溶液中DTX总质量，记为W总。精密吸取“2.3”项下GA-DTX-NGO/IONP-NPs1mL，置于超滤管中（分子量30kDa），以5000r/min离心15min，取上清液0.2mL，加甲醇破乳0.5h，再用甲醇定容至5mL，同法于230nm波长处测定溶液吸光度，按照“2.4.2(1）”项下DTX回归方程计算出溶液中DTX质量，记为W游。纳米粒混悬液中其他材料的质量根据加入量记为W其他。按公式计算包封率和载药量：包封率（%）=[（W总-W游）/W总]×100%；载药量（%）=[（W总-W游）/（W总+W其他）]×100%。结果，DTX的包封率为（94.29±0.50)%,RSD=0.53%(n=3）；载药量为(17.12±0.12)%,RSD=0.70%(n=3）。

2.5.4磁性检测

将GA-DTX-NGO/IONP-NPs置于西林瓶中，旁边放置磁铁，0.5h后室温下拍照，观察有或者无外加磁场时的状态，结果见图9。

图9GA-DTX-NGO/IONP-NPs有无外加磁场时的外观

由图9可知，GA-DTX-NGO/IONP-NPs在室温下为均匀黑色分散液，在外加磁场下能够迅速向磁场聚集得到澄清溶液，经振摇后又重新分散均匀。综合“2.2.3”项下结果，表明GA-DTX-NGO/IONP-NPs具有良好的磁定向性。

2.5.5光热转换试验

参考文献方法[21]进行光热转换试验。精密吸取GA-DTX-NGO/IONP-NPs适量，加水稀释，制成NGO/IONP质量浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4mg/mL的溶液，并以水为对照组（记为0mg/mL）。分别取上述溶液各3mL，置于石英比色皿中，采用激光器（2.5W/cm2）照射，激发波长为808nm，每30s记录1次温度。以时间（min）为横坐标、温度（℃）为纵坐标，采用Origin2019软件绘制光热转换曲线，结果见图10。

图10GA-DTX-NGO/IONP-NPs的光热转换曲线图

由图10可知，0.05、0.1、0.2、0.4mg/mL4个质量浓度的GA-DTX-NGO/IONP-NPs随着照射时间的延长，其温度均先快速上升，而后趋于平缓；且质量浓度越大，温度上升速度越快。试验过程中对照组温度几乎无变化。结果表明，GA-DTX-NGO/IONP-NPs具有浓度和时间依赖趋势的光热转换特性。

3、讨论

以CS作为纳米粒的载体材料，不仅安全无毒，且能够大幅提高药物的包封率及载药量，有效改善DTX入血后血药浓度低、生物利用度低等缺点。采用GA靶向修饰CS，利用GA良好的肝靶向性能赋予纳米粒主动靶向性，有望提高药物的肝肿瘤靶向性。

在肿瘤的治疗中，磁热疗法往往要与化疗结合。NGO/IONP作为磁热疗法中采用的常见纳米材料之一，因其独特的理化特性和光学性质，具有缓释性、靶向性及血脑屏障穿透性等优点，多用作肿瘤药物的载体从而进行靶向治疗[22,23]。NGO/IONP纳米尺径的大小会影响药物载体结合后的稳定性、纳米粒的成形甚至靶向定位效果，故对磁性材料尺径的调控至关重要。本研究所合成的NGO/IONP粒径在200nm左右，对纳米粒的成形基本没有干扰作用。目前，关于NGO/IONP的研究大多只限于细胞试验和动物实验，真正用于临床上的成熟剂型很少，且国际上对其毒性大小也没有一个公认的标准，故NGO/IONP的安全性及稳定性仍需进一步考察改进，以期未来其能在肿瘤的诊断与治疗中发挥更大的作用。

本研究所制备的GA-DTX-NGO/IONP-NPs分散性良好、粒径大小较为均匀、包封率和载药量均较高，在外加磁场下可定向移动，具有良好的光热转换性能，可为将其应用于肝肿瘤磁热-化疗联合治疗提供一定的理论依据。

参考文献:

[1]郑荣寿,孙可欣,张思维,等.2015年中国恶性肿瘤流行情况分析[J].中华肿瘤杂志,2019,41(1):19-28.

[5]陈路锋,钟红珊,徐克.基于氧化铁的磁性纳米颗粒在肿瘤诊疗中的应用进展[J].中国肿瘤临床,2019,46(8):416-420.

[6]杜夏夏,舒刚,陈宗艳.氧化石墨烯在生物医学领域的应用[J].功能材料,2018,49(8):8040-8047.

[10]曹熙.多西紫杉醇聚合物胶束的研究进展[J].中国新药杂志,2017,26(10):1137-1143.

[13]张丽娟,喻红梅,张勇,等.甘草次酸纳米粒的制备､表征及其抗肿瘤活性研究[J].中国药房,2020,31(13):1589-1594.

[15]高君.磁性氧化石墨烯的制备及其作为药物载体的初步研究[D].郑州:郑州大学,2014.

[16]马亚萍,黄一平,赵呈雷,等.温敏性甘草次酸/壳聚糖药物载体的制备及其胶束的性能研究[J].中国新药杂志,2015,24(23):2733-2739.

[18]刘丽丽,史畑女,方蕾,等.马钱子总碱-白芍总苷脂质立方液晶纳米粒制备及体外评价[J].中草药,2019,50(17):4076-4083.

[19]国家药典委员会.中华人民共和国药典:四部[S].2015年版.北京:中国医药科技出版社,2015:38-40.

[21]祝侠丽,王莎莎,李玲华,等.甘草次酸修饰纳米氧化石墨烯递药系统的制备与表征[J].中国中药杂志,2019,44(21):4621-462.

[23]赵鹏慧,王彦,刘雪颖,等.叶酸修饰磁性氧化石墨烯载体的制备､表征及其磁性研究[J].中国药房,2019,30(15):2061-2065.

王莎莎,陈家琦,王华华,黄胜楠,贾永艳,祝侠丽.甘草次酸修饰多西紫杉醇磁性纳米粒的制备与表征[J].中国药房,2020,31(19):2345-2350.

基金:国家自然科学基金资助项目(No.81803740);河南中医药大学博士科研基金项目(No.BSJJ2016-02).