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UPLC-MSMS法同时测定炎可宁片中5种成分的含量

2020-10-17 508 上传者：管理员

摘要：目的:建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法同时测定炎可宁片中黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、腺苷、大黄素的含量方法。方法:固定相为ACQUITYUPLCBENC18色谱柱(2.1mm×50mm,1.7μm),流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液,梯度洗脱;采用电喷雾离子源(ESI),正、负离子同时检测,多反应监测模式(MRM)。结果:黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、腺苷、大黄素的线性范围分别为1.958～195.789mg/L(r=0.9995)、0.205～20.496mg/L(r=0.9996)、0.025～2.453mg/L(r=0.9997)、0.00509～0.50900mg/L(r=0.9999)、0.00509～0.50880mg/L(r=0.9997),线性关系良好,平均加样回收率(n=6)为87.58%～96.70%,RSD为2.42%～3.12%。结论:该方法快速、准确、灵敏度高,可用于炎可宁片的质量评价及控制。

关键词：
含量测定
成分
炎可宁片
药学研究
超高效液相色谱-串联质谱法
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炎可宁片由黄柏、大黄、黄芩、板蓝根、黄连5味中药组成,具有清热泻火、消炎止痢的功效,用于急性扁桃体炎、细菌性肺炎等[1]。目前,炎可宁片的质量标准较多,但鉴别专属性较差,无含量测定;或仅有针对个别药味的鉴别和含量测定,未包含所有药味。炎可宁片中含有多个药味,每个药味又含有多种化学成分[2,3,4,5,6],药品质量需要全面控制。采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法来控制中成药质量,可同时测定多种成分,可不要求被测成分完全分离,且具有更高的专属性和灵敏度[7,8,9]。本研究采用UPLC-MS/MS法对炎可宁片中黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、腺苷、大黄素的含量测定方法进行考察和优化,大大提高了检测效率和准确度,为炎可宁片质量标准的完善提供了有力支撑。

1、药品、试剂与仪器

炎可宁片为吉林吉春制药股份有限公司产品(批号150703,161001,161002)、四川省三星堆制药有限公司产品(批号160909,170207,170211)、四川省旺林堂药业有限公司产品(批号161202,170201)、太极集团四川绵阳制药有限公司产品(批号1609003)、辽宁金丹药业有限公司产品(批号20160401)。黄芩苷对照品(纯度93.5%,批号110715-201619,)、盐酸小檗碱对照品(纯度86.7%,批号110713-201814)、盐酸黄柏碱对照品(纯度93.9%,批号111895-201202)、腺苷对照品(纯度100%,批号110879-200202)、大黄素对照品(纯度98.7%,批号110756-201512),均购自中国食品药品检定研究院;乙腈、甲醇为色谱纯,均为德国默克公司产品;甲酸为质谱纯,美国Fisher公司产品;水为纯净水。ACQUITYUPLC超高效液相色谱仪,美国Waters公司产品;4000QTrap质谱分析仪,美国Absciex公司产品;XS205DU电子分析天平,瑞士MettlerToledo公司产品;KQ5200DE型数控超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司产品。

2、方法与结果

2.1色谱与质谱条件

2.1.1色谱条件

色谱柱为ACQUITYUPLCBENC18(2.1mm×50mm,1.7μm),流动相为乙腈(A)-体积分数1mL/L甲酸溶液(B),体积流量0.3mL/min,柱温30℃,进样量1μL。梯度洗脱程序:0-3min,20%→90%A;3-4min,90%A;4-4.5min,90%→20%A。

2.1.2质谱条件

电喷雾离子源(ESI),正、负离子切换模式扫描,多重反应监测模式(MRM),源喷射电压:5500V(正离子模式),-4500V(负离子模式);源温度550℃;雾化气(GAS1,GAS2)压力50psi,气帘气压力(CAD)20psi,碰撞反应气为氮气。5个待测成分的质谱参数见表1。

表1黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、腺苷和大黄素的质谱参数

注:*为定量离子对。

2.2混合对照品溶液制备

精密称取黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、腺苷、大黄素对照品适量,分别置于适合的量瓶中;取适量体积置同一个10mL量瓶中,加甲醇制成混合对照品贮备溶液。精密量取上述混合对照品贮备溶液1mL,置于10mL量瓶中,加甲醇定容,制成混合对照品溶液,质量分数分别为19.5789,2.0496,0.2453,0.0509,0.0509mg/L。

2.3供试品溶液制备

取本品10片,除去包衣,研细,取约0.1g,精密称定,置锥形瓶中,精密加入体积分数700mL/L甲醇50mL,称定质量,超声30min,放至室温,再称定质量,用700mL/L甲醇补足减失的质量,摇匀,用0.22μm微孔滤膜滤过,得到供试品溶液。

2.4阴性对照溶液制备

将空白辅料,按炎可宁片的处方比例混合,按照炎可宁片的制备工艺制得阴性对照样品,按2.3项下的方法制备阴性对照溶液。

2.5专属性试验

按2.1项下的色谱与质谱条件,分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各1μL,进样测定,结果见图1。结果显示:阴性对照溶液在各成分提取离子流图的相应位置上没有干扰,专属性强。

图15种成分的提取离子流图

图15种成分的提取离子流图下载原图

1．腺苷;2．盐酸黄柏碱;3．黄芩苷;4．盐酸小檗碱;5．大黄素A．对照品溶液;B．供试品溶液;C．阴性对照溶液

图15种成分的提取离子流图

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1．腺苷;2．盐酸黄柏碱;3．黄芩苷;4．盐酸小檗碱;5．大黄素A．对照品溶液;B．供试品溶液;C．阴性对照溶液

图15种成分的提取离子流图

1．腺苷;2．盐酸黄柏碱;3．黄芩苷;4．盐酸小檗碱;5．大黄素A．对照品溶液;B．供试品溶液;C．阴性对照溶液

2.6线性关系考察

精密量取2.2项下的混合对照品贮备溶液0.1,0.5,1,5mL,分别置10mL量瓶中,加甲醇定容,制成系列浓度对照品溶液,进样分析。以对照品质量分数为横坐标(X),以峰面积为纵坐标(Y)进行回归,再分别以信噪比S/n=3、S/n=10时的质量分数作为检测限和定量限,结果见表2。结果表明:各成分在各自范围内线性关系良好。

2.7精密度试验

取2.2项下的混合对照品溶液,连续进样6次。结果:黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、腺苷、大黄素峰面积的RSD分别为1.37%、2.21%、2.42%、4.59%、4.33%。结果表明:该方法的精密度符合要求。

表2线性关系、检测限和定量限

2.8重复性试验

取批号为150703的炎可宁片细粉各6分,平行制备6份供试品溶液,进样测定。结果测得黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、腺苷、大黄素的平均含量依次为1.080,1.800,0.342,0.0091,0.048mg/片,其RSD依次为2.12%、2.38%、2.58%、4.87%、3.66%。结果表明:本方法重复性符合要求。

2.9稳定性试验

取同一份批号为150703的供试品溶液,在室温下放置0,2,4,6,8,10,12h后测定。结果:黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、腺苷、大黄素峰面积的RSD依次为2.30%、2.62%、2.76%、4.03%、2.59%。结果表明:该供试品溶液在12h内稳定。

2.10加样回收率试验

取同一批炎可宁片(批号150703),分别精密称取6份0.05g细粉,分别精密加入混合对照品贮备溶液适量,平行制备6份加标供试品溶液,计算加样回收率。结果:黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、腺苷、大黄素的平均加样回收率依次为96.63%、96.70%、93.16%、87.58%、90.27%,其RSD依次为2.42%、2.56%、3.12%、2.95%、2.84%。

2.11供试品含量测定

分别取10批炎可宁片,按照2.3项下方法制备供试品溶液,进样分析,通过回归方程计算含量,结果见表3。

表3供试品中黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、腺苷、大黄素含量的测定结果

3、讨论

3.1目标化合物的选择

炎可宁片现行的质量标准较多,但在鉴别和含量测定中均未涉及板蓝根中的化学成分,即未对炎可宁中板蓝根这一药味进行质量控制。本试验考察了板蓝根中的多个指标性成分。《中国药典》2015版一部中含有板蓝根的中成药将(R,S)-告依春作为指标性成分,但炎可宁片中(R,S)-告依春的含量非常小。靛玉红是板蓝根中的主要成分,但水溶性较差,在炎可宁片中的含量也极低。腺苷等核苷类成分在板蓝根中的含量比较高,对板蓝根及其制剂的品质影响较大,因此选取了腺苷作为指标性成分。本实验从炎可宁片每一味中药中选取了一种指标选成分,这5种化合物包含了黄酮、生物碱、核苷和蒽醌类4种结构类型,对炎可宁片进行较全面的质量控制研究。

3.2供试品提取方法的考察

本研究分别对提取方式、提取溶剂、提取时间进行研究和优化。对于提取方式,笔者分别考察了超声和回流,鉴于两者的提取率差异不大,超声提取的操作较简便,故选择超声的提取方式。对于提取溶剂,笔者分别考察了甲醇、500mL/L甲醇、700mL/L甲醇、900mL/L甲醇,结果以700mL/L甲醇的提取率较高。对于提取时间,笔者分别考察了20min、30min、40min,结果显示30min的提取率明显高于20min,但与40min的无明显差异。为了节省时间,笔者选择提取时间为30min。最终确定供试品提取方法是700mL/L甲醇超声提取30min。

3.3色谱条件的优化

对于流动相,笔者分别采用相同比例的甲醇-水、甲醇-1mL/L甲酸、乙腈-水、乙腈-1mL/L甲酸进行试验。结果显示,乙腈比甲醇的洗脱能力更强,各化合物的保留时间较合适。与纯水相比,一定体积分数的甲酸溶液可使这5种化合物的信号响应明显增强,且使峰形更加对称。对甲酸的体积分数进行优化时,显示:当体积分数为1mL/L时,流动相的洗脱能力更强,信号响应更高。采用梯度洗脱方式是考虑到其可有效提高洗脱能力和分离效率,缩短分析时间。因此,选择乙腈-1mL/L甲酸作为流动相,采用梯度洗脱方式进行试验。

综上所述,本研究建立了UPLC-MS/MS同时测定炎可宁片中5个成分含量的方法。该方法灵敏度高,重复性好,专属性强,测定迅速,结果准确。与现行质量标准相比,该方法能提高检测效率和准确度,可为炎可宁片质量标准的进一步完善提供可靠依据。

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