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测定葆肾合剂中6种成分的含量

2021-01-19 200 上传者：管理员

摘要：目的：建立高效液相色谱波长切换法同时测定葆肾合剂中绿原酸、咖啡酸、芒果苷、薏苡素、鞣花酸及毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量。方法：色谱柱WatersXBridgeC18(250mm×4.6mm,5μm);流动相乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B),梯度洗脱;流速1.0mL•min-1;柱温30℃;进样体积10μL;检测波长为326nm(绿原酸、咖啡酸、芒果苷、薏苡素)和254nm(鞣花酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷)。结果：该条件下所测6种成分的色谱峰分离度较好,其他成分对测定无干扰。绿原酸、咖啡酸、芒果苷、薏苡素、鞣花酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷分别在3.26～74.34μg•mL-1(r=0.9999)、1.72～39.20μg•mL-1(r=0.9999)、1.61～36.85μg•mL-1(r=0.9998)、2.17～36.34μg•mL-1(r=0.9999)、1.65～37.65μg•mL-1(r=0.9999)、3.28～74.96μg•mL-1(r=0.9999)与峰面积线性关系良好,平均加样回收率均大于96.0%,RSD均小于3.0%。结论：建立的方法准确可靠、操作简便、重复性好,可用于葆肾合剂的质量控制。

关键词：
咖啡酸
波长切换法
芒果苷
葆肾合剂
高效液相色谱
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葆肾合剂是在临床经验的基础上研发出的院内自制制剂,处方由芡实、黄芪、米仁根、金樱子、覆盆子、僵蚕、石韦7味中药组成,具有健脾益肾、清热利湿的功效。作为“益肾固络”法,是治疗早中期慢性肾脏病的基本方,广泛应用于临床,疗效显著。鉴于其良好的临床疗效和应用前景,应制订制剂的质量标准,为制剂的进一步开发提供必要的技术研究基础资料。

目前,已有对于葆肾合剂提取工艺及临床疗效的研究[1,2],质量标准中对方中的黄芪、金樱子和覆盆子进行了定性鉴别,但并未进行定量控制。中药复方的疗效是多组分协同作用的结果[3,4],为了更全面地控制葆肾合剂的质量,保证临床疗效,本研究建立了高效液相色谱波长切换法同时测定葆肾合剂中黄芪(毛蕊异黄酮葡萄糖苷)、米仁根(薏苡素)、金樱子、覆盆子(鞣花酸)及石韦(绿原酸、咖啡酸、芒果苷)5味药材多指标成分的定量方法[5,6,7,8,9],以期为制剂的开发和质量控制提供依据。

1、材料

1.1仪器

Agilent1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司),DAD二极管阵列检测器(美国Agilent公司);BSA224S-CW电子天平(德国Sartorius公司);DGG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司);KQ-100型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药

薏苡素(批号:J24M10L89214)、咖啡酸(批号:W16010B100366)、芒果苷(批号:P04M9F60454)(纯度均≥98%,上海源叶生物科技有限公司);毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号:111920-201606,供含量测定用,纯度:97.6%)、鞣花酸(批号:111959-201602,纯度:98.3%)、绿原酸(批号:110753-201817,纯度:96.8%)(中国食品药品检定研究院);乙腈、磷酸(色谱纯,美国Fisher公司);水为超纯水,其余试剂均为分析纯。

供试验用的葆肾合剂由制剂室根据处方将7味药材提取、浓缩、灭菌、灌装制得,共制成3个批次,批号分别为:191201、191202、191203。

1.3药材饮片

药材购自不同批号、不同厂家和不同产地,经无锡市中医医院副主任中药师胡敏敏鉴定符合药典规定。芡实(批号:190215,江苏苏轩堂,产地:广东);黄芪(批号:191126,南京海源,产地:甘肃);米仁根(批号:190801,东方慧医华康,产地:贵州);金樱子(批号:190415,江苏苏轩堂,产地:江西);覆盆子(批号:190401,苏州春晖堂,产地:浙江);炒僵蚕(批号:190901,东方慧医华康,产地:江苏)。

2、方法与结果

2.1色谱条件[10]

色谱柱:WatersXBridgeC18(250mm×4.6mm,5µm);柱温30℃;流动相:乙腈(A)-0.2%磷酸水(B),检测波长分别为326nm(0～26min:检测绿原酸、咖啡酸、芒果苷、薏苡素)和254nm(26～75min:检测鞣花酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷);梯度洗脱(0～10min,92%B;10～12min,92%→89%B;12～50min,89%B;50～65min,89%→80%B;65～75min,80%→92%B);流速1.0mL·min-1;进样体积10µL。

2.2混合对照品溶液[11]

精密称取绿原酸、咖啡酸、芒果苷、薏苡素、鞣花酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量,加甲醇溶解,配制成每1mL含绿原酸1.92mg、咖啡酸1.01mg、芒果苷4.7mg、薏苡素1.38mg、鞣花酸1.06mg和毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.96mg的混合对照品溶液,用0.22µm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

2.3供试品溶液

按葆肾合剂处方组成,称取不同批号和产地的药材,加10倍量水,浸泡30min,煎煮3次,每次煎煮2h。分装制成每瓶200mL,即得,共制成3个批次。精密量取3批葆肾合剂样品各1.5mL,置5mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,超声(100W,40kHz)10min,放冷后甲醇定容至刻度,摇匀,用0.22µm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

2.4阴性样品溶液

按“2.3”项下方法分别制备缺黄芪、米仁根、石韦、覆盆子和金樱子的阴性样品溶液,备用。

2.5专属性考察[12,13]

取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样10µL,结果基线稳定,峰形对称,分离度较好,峰信息量大,各峰保留时间适中,能够满足含量测定的需要,见图1。

2.6线性关系考察

精密移取“2.2”项下混合对照品溶液适量,加甲醇溶解,稀释制成不同浓度的系列溶液,0.22µm微孔滤膜滤过,按“2.1”项下色谱条件进样,记录峰面积。以各对照品质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,得线性回归方程:绿原酸为Y=12.22X-15.13,r=0.9999,线性范围为3.26～74.34µg·mL-1;咖啡酸为Y=33.86X-16.759,r=0.9999,线性范围为1.72～39.20µg·mL-1;芒果苷为Y=7.444X-4.038,r=0.9998,线性范围为1.61～36.85µg·mL-1;薏苡素为Y=15.78X-4.972,r=0.9999,线性范围为2.17～36.34µg·mL-1;鞣花酸为Y=98.30X-61.00,r=0.9999,线性范围为1.65～37.65µg·mL-1;毛蕊异黄酮葡萄糖苷为Y=23.79X-25.58,r=0.9999,线性范围为3.28～74.96µg·mL-1。

图1葆肾合剂的高效液相色谱图

2.7精密度试验

取“2.2”项下混合对照品溶液,按“2.1”项下色谱条件,连续进样6次,记录绿原酸、咖啡酸、芒果苷、薏苡素、鞣花酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的峰面积,结果峰面积RSD分别为0.44%、0.36%、0.28%、0.54%、0.21%和0.39%,表明仪器精密度良好。

2.8重复性试验

取批号为191202的葆肾合剂,按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录绿原酸、咖啡酸、芒果苷、薏苡素、鞣花酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的峰面积,结果峰面积RSD分别为1.8%、2.0%、1.5%、2.2%、2.1%和1.4%,表明该方法重复性良好。

2.9稳定性试验

取“2.3”项下供试品溶液(批号:191202),按“2.1”项下色谱条件,分别在0、1、2、4、8、16h测定,结果绿原酸、咖啡酸、芒果苷、薏苡素、鞣花酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积的RSD分别为2.1%、1.1%、2.2%、0.96%、1.7%和1.5%,表明供试品溶液在16h内稳定。

2.10加样回收试验

精密量取葆肾合剂提取液0.75mL,按1∶1精密加入混合对照品溶液0.5mL,按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液,进样测定,记录峰面积。结果绿原酸、咖啡酸、芒果苷、薏苡素、鞣花酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的平均加样回收率分别为96.7%、98.0%、97.9%、99.9%、97.1%和98.2%,RSD分别为1.8%、1.8%、2.2%、2.8%、2.2%和2.5%。

2.11样品测定

取3批葆肾合剂样品,按“2.3”项下方法平行制备3份供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样,结果见表1。

3、讨论

3.1指标成分的选择

中药制剂具有多成分、多靶点作用的特点,目前国内外正逐渐采用多指标、多手段等中药质量评价模式,最终达到控制其整体质量的目的[14,15]。本方以芡实为君药,益肾固摄、健脾除湿;臣药以黄芪益气固摄,米仁根清利湿热;佐药以金樱子、覆盆子助芡实益肾固摄;以石韦助米仁根清利湿热;以僵蚕为使,增搜剔通络之力,使诸药达于病所,发挥更好的疗效。方中芡实为君药,以碳水化合物为主(82.6%),另有少量蛋白质(6.78%)、脂肪(0.71%)和微量元素等[16],但其中医功效物质基础始终未能明确[17]。臣药黄芪所含主要成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、米仁根主要成分薏苡素,佐药金樱子、覆盆子代表性成分鞣花酸,石韦主要成分绿原酸、咖啡酸和芒果苷,故选择这几个成分作为指标进行定量控制。

表1葆肾合剂中6种成分的含量测定结果

3.2色谱柱的选择

采用不同色谱柱[WatersXBridgeC18(250mm×4.6mm,5µm),YMC-PackODS-AC18(250mm×4.6mm,5µm),AgilentEclipseXDB-C18(250mm×4.6mm,5µm)],考察其对特征峰分离度的影响,最终选择WatersXBridgeC18色谱柱,可以达到有效成分分离测定的要求,且准确可靠、重复性好。

3.3流动相的选择

通过对比不同流动相系统对分离效果的影响,选择乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液等流动相进行考察,结果表明乙腈-0.2%磷酸溶液为流动相梯度洗脱时,基线平稳,各峰分离度良好。

3.4检测波长的确定

在建立液相方法时,采用DAD检测器进行全波长(200～400nm)扫描[18,19],发现由于制剂中有效成分性质差异较大,不同成分最大吸收波长不一致,为减小波长对含量测定结果的影响,最终确定采用波长切换法,在326nm处测定绿原酸、咖啡酸、芒果苷和薏苡素,在254nm处测定鞣花酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷。

3.5小结

本试验建立了HPLC波长切换法同时测定葆肾合剂中绿原酸、咖啡酸、芒果苷、薏苡素、鞣花酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量,该方法简便可靠、准确度高、重复性好,为葆肾合剂质量评价和控制提供了依据。

参考文献：

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