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效应面法优选甘露饮的提取工艺

2021-01-19 251 上传者：管理员

摘要：目的：优化甘露饮的提取工艺。方法：以大鼠口腔溃疡的药效学实验结果为指标筛选甘露饮的提取工艺,再以液料比、提取时间、提取次数为考察因素,粉末得率为考察指标,采用星点设计-效应面法优化甘露饮的提取工艺,高效液相色谱测定粉末中有效成分的转移率,并对工艺进行验证试验。结果：筛选的最佳工艺路线为全方60%乙醇回流提取,最佳提取工艺参数为液料比4∶1,提取时间180min,提取1次,粉末中有效成分的转移率均大于70%。结论：通过药效学结合星点设计-效应面法建立甘露饮最佳提取条件,该提取工艺条件稳定、可行。

关键词：
提取工艺
效应面法
星点设计
甘露饮
药效学
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甘露饮出自《太平惠民和剂局方》,为传统中药方剂,临床上主要用来治疗各种口腔疾病,如口腔溃疡、齿龈肿烂等[1,2,3,4,5,6,7],目前临床应用以汤剂为主。由于汤剂煎煮麻烦、不方便携带,导致患者依从性差,已经不能满足患者的用药需求[8,9,10,11]。中药颗粒剂作为一种常用中药剂型,具有携带方便、稳定性好、吸收快的优点。

星点设计-效应面优化法是由析因设计加轴点和中心点组成的方法,近年来在药学制剂工艺优化和处方筛选中的应用十分广泛[12,13]。本研究旨在通过结合药效学实验筛选甘露饮的提取工艺路线,并在此基础上以喷干粉的粉末得率为指标,采用星点设计-效应面法优化提取工艺,并通过高效液相色谱法(HPLC)测定喷干粉中有效成分的转移率,从而保证制剂的质量和药效,为甘露饮颗粒剂研究与开发奠定基础。

1、材料

1.1仪器

1260型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司);DZTW型电子调温电热套(天津市工兴电器厂);RV10型旋转蒸发仪(IKA科技有限公司);B290型喷雾干燥器(瑞士步琦实验室仪器公司);KH3200E型超声清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);十万分之一电子天平、千分之一电子天平(北京赛多利斯有限公司)。

1.2试药

生地黄(批号:1812205)、熟地黄(批号:18122504)、麦门冬(批号:181128)、天门冬(批号:18072302)、石斛(批号:18031307)、茵陈(批号:180713)、枳壳(批号:18081002)、蜜制枇杷叶(批号:18030609)、甘草(批号:180201)[四川禾一天然药业有限公司,经检验质量均符合2015年版《中国药典》一部各药材项下规定];熊果酸(批号:180926,纯度:99.6%)、柚皮苷(批号:181119,纯度:99.8%)、甘草酸(批号:180202,纯度:99.2%)、绿原酸(批号:181010,纯度:99.8%)、麦角甾苷(批号:181113,纯度:99.3%)、黄芩苷(批号:180921,纯度:99.9%)对照品(四川省食品药品检定研究所)。甲醇(色谱纯,格玛奥德里奇上海贸易有限公司),氢氧化钠、无水乙醇(分析纯,成都市科隆化学品有限公司)。

1.3动物

SPF级SD大鼠25只,其中雌鼠13只,雄鼠12只,体质量180～220g(成都达硕实验动物有限公司),动物许可证号:SCXK(川)2020-030。

2、方法与结果

2.1药效学结合初步筛选甘露饮提取工艺路线

2.1.1甘露饮处方组成

甘露饮出自《太平惠民和剂局方》,方剂组成:生地黄、熟地黄、麦门冬、天门冬、石斛各15g,枳壳、茵陈、蜜制枇杷叶各10g,甘草片6g,处方中药饮片总质量为121g。

2.1.2甘露饮提取工艺路线设计与提取物制备

中药方剂经过上千年的临床应用,已经证明其配伍的合理性,甘露饮方剂目前临床主要用于口腔溃疡的治疗,口腔溃疡的形成必然伴有炎症,因此溶剂对方剂中抗炎成分的提取率会直接影响药效。通过前期预实验,共设计4条提取工艺路线,提取时间均为2h,提取次数为2次,提取完成后,将各组提取液旋蒸浓缩至以生药计含量为1g·mL-1,详细提取工艺路线设计见表1。

表1甘露饮提取工艺路线

2.1.3动物分组及造模

SD大鼠随机分为5组:模型组、工艺Ⅰ、工艺Ⅱ组、工艺Ⅲ组、工艺Ⅳ组(n=5),实验前称重并对各组大鼠进行编号。造模前大鼠禁食12h,各组大鼠经腹腔注射约0.5mL10%水合氯醛(300mg·kg-1)麻醉后,均在左侧黏膜接受氢氧化钠片灼烧,灼烧时间约35s,氢氧化钠片大小约为3mm×3mm。氢氧化钠烧灼口腔内壁黏膜导致口腔内壁黏膜破损进而形成溃疡,待溃疡形成后,各组均采用灌胃给药,剂量为10mL·kg-1(人每日给药剂量为2g·kg-1,按照人与大鼠给药剂量进行换算大鼠给药剂量),模型组灌胃给予10mL·kg-1蒸馏水,不同提取工艺组给予10mL·kg-1提取浓缩液,同时注意在给药灌胃时小心避免灌胃针刮蹭到口腔溃疡面,导致溃疡加重影响实验。以上各组大鼠每日给药1次,连续给药直至所有组别的大鼠溃疡愈合。各组大鼠自造模之日起和给药后每日观察大鼠口腔溃疡愈合情况,记录各组大鼠愈合天数,并在给药前后给药后第2、5、7、10日对大鼠称重,并采取尾静脉采血法收集大鼠全血约0.3mL于EP管中。血样先室温静置30min,然后3000r·min-1离心15min,收集上层血清[6]。按照ELISA试剂盒的指导说明,采用全波长酶标仪在450nm条件下检测各组大鼠血清炎症因子含量。各组大鼠观察和检测所得数据均采用平均数±标准差进行描述,使用统计学软件SPSS21.0进行单因素方差分析[14]。

2.1.4口腔溃疡药效实验结果

大鼠在接受氢氧化钠片灼烧复制口腔溃疡后,均能耐受至实验结束。造模前大鼠口腔黏膜光滑平整无破损,造模后大鼠口腔黏膜呈红肿或破损,随着溃疡逐渐形成,溃疡处变黄,到最后逐渐痊愈形成瘢痕。20d左右所有组别的大鼠口腔溃疡基本痊愈。各组痊愈天数、体质量变化、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)等变化结果见表2～4。

表2各组痊愈天数比较分析结果

表3各组口腔溃疡大鼠体质量变化

工艺Ⅲ、Ⅳ组药效学显著优于工艺Ⅰ、Ⅱ组,表明采用60%的乙醇提取效果更好,工艺Ⅲ、Ⅳ组比较药效学没有显著差异,Ⅳ组提取方法操作更简便,所以选择工艺Ⅳ进行后续研究。

2.2星点设计-效应面法实验设计

2.2.1评价指标

选择每一个实验方法得到的浓缩药液经喷雾干燥所得的粉末取得率(Y)为评价指标,计算公式。

2.2.2因素水平选择

选择液料比(X1)、提取时间(X2)、提取次数(X3)作为考察对象,每个因素均设5个水平,3个因素,见表5。

表4各组大鼠TNF-α含量水平变化

表5因素与水平

2.2.3实验设计及结果

实验方案由软件Dsign-Expert.V8.0.6生成。以500mL60%乙醇为溶剂提取,提取液旋蒸浓缩至以生药计含量为1g·mL-1。分别取浓缩药液进行喷雾干燥[15]。收集干燥粉末,称重并记录数据,按照“2.2.1”下公式计算粉末取得率。具体实验方案及结果见表6。

2.2.4模型拟合

采用软件Desing-Expert.V8.0.6对表7中的数据进行模型拟合,通过模型拟合建造出数学模型,模型拟合的优劣用方差分析来评价,选出最佳的拟合模型。

表6实验设计与结果

表7二次多项式模型方差分析

数学模型:Y=8.67972+0.83836X1+0.022492X2+2.17233X3+5.45061×104X1X2+0.32322X1X3-6.6571X2X3-0.14747X12-8.45938E-005X22-1.68130X32

根据表7模型P值为0.0002,表明模型具有显著的统计学意义,模型成立。液料比和提取次数P<0.0001,表明液料比和提取次数对粉末取得率的影响差异有显著统计学意义。决定系数为0.9251,接近于1。校正决定系数为0.8477,表明该模型能解释84.77%效应面值的变化。预测决定系数为0.8474,表明该模型能预测解释84.74%的效应面值变化。模型的精密度为21.657,精密度合格。经过星点设计效应面法得到最佳提取条件为液料比4∶1,提取时间180min,提取1次。二次多项式回归模型等高线和3D图见图1和2。

图1二次多项式回归模型等高线

图2二次多项式回归模型3D图

2.2.5验证实验结果

使用模型预测得到最佳提取条件,预测粉末取得率为13.0379%。按照优化预测得到的最佳提取条件,以500mL60%乙醇为溶剂进行提取,再分别对所得药液旋蒸浓缩后进行喷雾干燥,收集粉末,称重并记录数据,按照“2.2.1”项下公式计算粉末取得率并记录数据。

由表8结果可知,实际粉末取得率与预测粉末取得率平均偏差小于2%,证明预测最佳提取条件在实际实验操作中稳定可行。

表8验证实验结果

2.3喷干粉转移率测定

2.3.1对照品溶液配制

精密称取绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸和熊果酸对照品适量,置于量瓶中,加甲醇配制成质量浓度分别为0.5、0.5、1.0、1.0、0.5、0.5mg·mL-1的对照品储备液,待用。

2.3.2样品溶液制备

将工艺Ⅳ组提取液浓缩后按照文献方法进行喷雾干燥[15],精密称取样品粉末0.150g,甲醇溶解,定容至5mL,超声10min,冷却至室温,补充甲醇减失量,即得样品溶液。

2.3.3色谱条件及系统适应性

sepaxMGE-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),柱温35℃,检测波长210nm,进样量5μL,流速为1mL·min-1,流动相为乙腈(B)和0.1%磷酸水(A),洗脱梯度如表9。将空白溶剂(甲醇)及“2.3.1”和“2.3.2”项下混合对照品溶液和样品溶液进样测定,见图3。由结果可知,6种成分所得峰能达到基线分离,峰形较好且稳定,其他成分对检测没有干扰。

表9HPLC的梯度洗脱程序

2.3.4线性范围考察

分别精密吸取“2.3.1”项下绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸和熊果酸对照品储备液适量配制成系列浓度的混合对照品溶液,分别精密吸取5μL,进样测定,以峰面积(y)对质量浓度(x)进行线性回归并绘制标准曲线,结果见表10,6种成分在各自范围内线性关系良好。

2.3.5转移率测定

将甘露饮处方按照工艺Ⅳ进行提取浓缩,按照“2.3.2”项下方法制备样品溶液,提取浓缩液和样品溶液均平行制备3份,按照“2.3.3”项下色谱条件进样测定,记录浓缩液和样品溶液中各有效成分的峰面积,代入标准曲线方程计算喷干粉中有效成分的转移率,计算公式见公式(2)。结果绿原酸、麦角甾苷酸、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸、熊果酸的转移率分别为89.54%、70.29%、94.27%、95.35%、82.47%、80.37%。甘露饮中有效成分的转移率均在70%以上,转移率较好。

3、讨论

图3空白溶剂(A)、混合对照品溶液(B)和样品溶液(C)HPLC图

表10甘露饮方剂中6种有效成分线性关系

在提取工艺优化过程中,正交实验设计是目前国内应用得比较成熟的方法,但是存在实验精度不够,建立的数学模型预测性差,选择的实验取值仅仅是接近最佳取值,无法精确找到最佳点,不能灵敏地考察各因素间的交互作用,而星点设计-效应面法是集数学与统计于一体,具有实验次数少、精密度高等特点;并且可对未知结果的实验进行预测,比正交实验设计更具优势,适用于多因素、多水平的实验,现已广泛应用于医药研究领域[16,17]。

在优化甘露饮提取工艺时,采用效应面优化法需同时考察多个因素对实验结果的影响,由于前期实验已确定最佳提取溶剂为60%乙醇,故本次实验选择液料比、提取时间、提取次数为影响因素进行考察。模型拟合中采用喷雾干燥粉末取得率为评价指标,而没有用有效成分转移率来考察,主要是因为有效成分含量测定采用梯度洗脱色谱条件,每一个样品需要分析100min,耗时较长,而前期预实验筛选了烘干、减压干燥、冷冻干燥和喷雾干燥等方法,通过测定发现采用喷雾干燥得到的喷干粉中有效成分转移率较好。同时浓缩液和喷干粉中6种有效成分转移率均大于70%,转移率较高,分析原因可能是采用喷雾干燥的方法,干燥温度较低,干燥时间短,有效避免了提取液中有效成分的损失。

本文通过药效学结合星点设计-效应面法优选甘露饮方的提取工艺,采取HPLC分别对甘露饮浓缩液和喷干粉中6种有效成分进行含量测定,并计算干燥前后有效成分的转移率,为甘露饮进一步开发奠定了基础。

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