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西南鬼灯檠UPLC-ECD指纹图谱建立

2021-01-19 120 上传者：管理员

摘要：目的：建立西南鬼灯檠中药材的UPLC-ECD指纹图谱,并进行聚类分析和主成分分析,为其质量控制和药物评价提供科学依据。方法：采用WATERSACQUITYUPLCHSST3色谱柱(2.1mm×100mm,1.8μm),以乙腈(A)-50mmol•L-1柠檬酸缓冲盐溶液(pH2.8,B)为流动相梯度洗脱,体积流量为0.4mL•min-1,检测电压为650mV,柱温为40℃,进样量为1μL。以14批西南鬼灯檠中药材样品绘制UPLC-ECD指纹图谱,采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行相似度评价,确定样品之间的共有峰,并采用SPSS24.0和SIMCA14.1软件对样品数据进行聚类分析和主成分分析。结果：14批西南鬼灯檠中药材的UPLC-ECD图谱有8个共有峰,共指认出3个成分,分别为没食子酸、岩白菜素、表儿茶素没食子酸酯。各样品间相似度在0.922～0.998,表明14批药材样品之间有一定的相似性。聚类分析与主成分分析均将14批样品分为两大类。经主成分分析,特征固有值>1且P<0.05的主要成分有3个,其累积方差贡献率为71.80%。结论：该方法可为西南鬼灯檠药材的质量评价提供参考。

关键词：
指纹图谱
聚类分析
西南鬼灯檠
超高效液相色谱法
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西南鬼灯檠(Rodgersiasambucifolia),为虎耳草科植物的干燥根茎,俗称为岩陀,分布于云南、贵州、四川等地,是白族、苗族及傈族等民族常用的特色药材,白族人称为散药,傈族人称为埃陀[1]。西南鬼灯檠根茎中含有多种成分,如岩白菜素、槲皮素、山柰酚等黄酮类成分[2,3,4]。其中岩白菜素又称虎耳草素,具有镇咳化痰的功效,在临床上多用于慢性支气管炎等呼吸道系统疾病的治疗,除此之外还具有活血调经及祛风除湿的作用,对跌打损伤、骨折、风湿性关节炎、月经不调、刀伤出血等疾病疗效颇佳。现代药理学研究表明,西南鬼灯檠的提取物中具有抗氧化、抗心律失常、肝保护、抗炎、抑制免疫作用的功效[5,6,7,8]。

指纹图谱是以系统的化学成分研究和药理学研究为依托,以系统的、较强的选择性来特征性地区分中药的真伪与优劣,将样品指纹图谱与建立起来的对照指纹图谱进行相似性比较,从而对药品质量进行评价和控制[9,10,11,12]。超高效液相色谱(UPLC)借助于高效液相色谱(HPLC)的理论及原理,涵盖了小颗粒填料、以非常低的系统体积及快速检测手段等全新技术,增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量,与HPLC相比,它缩短了分析时间、减少了溶剂用量,同时降低了分析成本。采用UPLC绘制中药材指纹图谱可以大幅度缩短分析时间,有效弥补了常规HPLC耗时较长的缺点。电化学检测器(electrochemicaldetect,ECD)是测量物质的电信号变化,可选择性地检测具有氧化还原性质的化合物,如带有硝基、巯基、酚羟基等基团的有机化合物[13]。近几年关于西南鬼灯檠成分含量研究比较少,且测定成分单一,也并未进行不同产地西南鬼灯檠的成分比较与质量分析,使用液相方法测定其成分多采用荧光检测或者紫外检测器,使用ECD测定并未见报道[8,14]。以岩白菜素为代表的酚类化合物是西南鬼灯檠的主要活性成分,相较于现有的检测方法,超高效液相色谱联合电化学检测器(UPLC-ECD)更加灵敏、准确,且减少了检测时间,降低了分析成本。本研究采用UPLC-ECD建立了不同产地西南鬼灯檠药材的指纹图谱,并对不同产地的西南鬼灯檠样品进行聚类分析和主成分分析,找寻样品间的差异并分析其中的原因。通过以上研究,期望能够发现不同产地的西南鬼灯檠药材中活性成分的含量差异,为更加全面地评价西南鬼灯檠药材质量提供方法,为西南鬼灯檠药材资源的开发和利用提供数据参考。

1、仪器与试药

1.1仪器

ThermoUltiMate3000bio-RS型UPLC仪,配备ECD-3000RS电化学检测器,检测池为6011库伦检测池(美国赛默飞世尔科技);GM-1.0A型真空泵(天津津腾科技有限公司);ME104E/02型电子分析天平(美国梅特勒-托利多);SB-5200DT型超声波清洗机(宁波新芝生物科技有限公司);PurelabChorus2型纯水超纯水系统(英国埃尔格);0.22μm针头过滤器(上海安谱试验科技股份有限公司)。

1.2试药

没食子酸(批号:G131992,纯度:97.0%)、岩白菜素(批号:B111464,纯度:98.0%)、表儿茶素没食子酸酯(批号:E101658,纯度:98.0%)对照品(上海阿拉丁生化科技股份有限公司),乙酸铵、乙腈、冰乙酸均为色谱纯,试验用水为试验室自制超纯水。共收集鬼灯檠药材样品14批,2019年9月3日采集的四川重庆地区样本,编号为S1～S4;2019年12月18日采集的贵州凯里地区样品,编号为S5～S8;2020年1月6日采集的贵州遵义地区的样品,编号为S9～S14。样品经遵义医科大学基础医学院顾丁副教授鉴定,全部为西南鬼灯檠。将收集来的西南鬼灯檠药材样品烘干后粉碎,过60目筛,密封后于阴凉干燥处保存。

2、方法

2.1色谱条件

色谱柱:ACQUITYUPLCHSST3(2.1mm×100mm,1.8μm);以乙腈(A)-50mmol·L-1柠檬酸缓冲盐溶液(pH2.8,B)为流动相,梯度洗脱,洗脱程序为:(0～5min,2.5%→7.5%A;5～25min,7.5%→18%A;25～26min,18%→50%A;26～27min,50%→2.5%A;27～30min,2.5%A);体积流量:0.4mL·min-1;检测电压:650mV;柱温40℃;进样量1μL。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备

分别精密称定没食子酸、岩白菜素、表儿茶素没食子酸酯3种对照品,加入甲醇溶解定容,配制成质量浓度为1mg·mL-1的混合对照品母液,-20℃储存备用。使用时再根据试验用量所需取混合对照品母液,稀释成所需浓度的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备

取“1.2”项下经处理的样品粉未0.2g于试管中,精密加入20%甲醇溶液10mL,称定质量,超声(功率:250W,频率:±1kHz)50min,用20%甲醇补足减少的质量,摇匀,离心后取上清液经0.22μm有机微孔滤膜过滤后进样检测。

2.3方法学考察

2.3.1精密度试验

取“2.2.2”项下供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次,记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果8个共有峰相对保留时间的RSD值在0.12%～0.18%,相对峰面积的RSD值在2.1%～2.4%,表明本方法精密度良好。

2.3.2稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液,室温下放置0、2、4、8、12、16、24h后按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果8个共有峰相对保留时间的RSD值在0.19%～0.23%,相对峰面积的RSD值在2.5%～3.0%,表明仪器稳定性良好。

2.3.3重复性试验

取样品粉末6份0.2g,精密称定,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,再按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果8个共有峰相对保留时间的RSD值在0.11%～0.20%,相对峰面积的RSD值在2.3%～2.7%,表明本方法重复性良好。

3、结果与分析

3.1UPLC指纹图谱的生成与相似度、共有峰相关性分析

3.1.1UPLC指纹图谱的生成

分别取14批药材样品粉末0.2g,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,再按“2.1”项下色谱条件进样测定,采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)软件对14批药材样品的UPLC图谱进行分析,将14批药材样品UPLC图按顺序导入,选定S8号样品作为参照图谱(见图1B),采用中位数法,时间窗设为0.1min,样品图经多点校正后,开始进行色谱峰的匹配,生成西南鬼灯檠的指纹图谱,详见图1。

图1西南鬼灯檠的超高效液相色谱图

3.1.2相似度分析

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版),以药材样品的UPLC-ECD对照指纹图谱为参照,进行整体相似度评价,结果见表1,14批药材样品相似度在0.922～0.998,且大部分样品的相似度在0.95以上。

3.1.3共有峰的指认及相关分析

14批西南鬼灯檠药材样品峰面积数据经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)处理后,以3号峰为参照峰,整理了共有峰相对峰面积及其RSD值,结果见表2,共得到8个共有峰,通过与对照品峰比较后,指认出3个峰,分别是没食子酸(1)、岩白菜素(3)、表儿茶素没食子酸酯(7),见图1C。

3.2聚类分析

使用数据统计软件SSPS24.0与SIMCA14.1对14批西南鬼灯檠药材样品测定的峰面积数据进行了主成分分析,数据经检验后得出KMO值为0.793。取特征值>1且统计显著水平P<0.05的数据作为主要成分,可将西南鬼灯檠的14批药材样品中的成分分为3个主成分,如表3所示,将处理后的数据绘制散点图,如图2所示。

表114批药材样品相似度评价结果

表214批药材样品UPLC-ECD图谱共有峰的相对峰面积及其RSD

图214批药材样品主成分因子得分散点图

表33个主成分因子的特征固有值和方差贡献率

3.3主成分分析

将14批西南鬼灯檠药材样品的主要成分进行提取分析之后,继续将14批西南鬼灯檠药材样品进行聚类分析,使用数据统计软件SSPS24.0,采用系统聚类法,聚类方法为组间联接法,聚类距离为平方欧式距离为对样品进行分类,结果如图3所示,可将14批样品分成两大类。编号为S1、S2、S4、S7号样品可聚类成第一大类,其中S1、S2号样品,S4、S7号样品各自聚成小类。S3、S9、S11、S12号样品与S5、S6、S8、S13号样品各自聚成小类,与S10、S14号样品聚类成第二大类,样品间关系较近。

4、讨论

4.1提取条件的优化

试验分别考察了不同提取溶剂(体积分数0%～100%甲醇,间隔10%)、不同超声提取时间(10、20、30、40、50、60min)和提取料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶80g/mL)对提取效率的影响。结果表明,在20%甲醇作为提取溶剂,料液比为1∶50,超声提取时间为50min的条件下,西南鬼灯檠样品中的化学成分的提取效率最高,色谱峰最多且总峰面积最大。因此选用该条件作为试验中的样品提取条件。

图314批药材样品聚类分析树状图

4.2检测器的选择

由于ECD选择性检测易于发生氧化还原反应的化合物,在直流模式下施加正向检测电压可以特异性检测酚酸、黄酮等还原性较强的化合物。而西南鬼灯檠色谱图中的主要色谱峰来自于酚酸、黄酮,其他干扰组分较少。文献报道以岩白菜素为代表的酚类化合物是西南鬼灯檠的主要药理活性成分,以UPLC-ECD建立的指纹图谱特异性针对其中的酚类化合物,色谱峰数量相对于紫外检测器较多,更易于进行谱峰分离和成分检测,对于西南鬼灯檠质量评价和资源开发具有积极的意义。

4.3共有峰相似度分析

UPLC-ECD构建的西南鬼灯檠指纹图谱共指认出8个共有峰,并且确定了1号峰为没食子酸、3号峰为岩白菜素、7号峰为表儿茶素没食子酸酯,且8个共有峰的相似度在0.922～0.998,大部分在0.95以上,所有的共有峰面积RSD值都在69%以上,表明14批药材样品质量虽有差异但也相对稳定。导致不同样本之间差异性的原因可能与地理环境、温度、采集时间、保存方式的不同有关。因为不同产地的降水量、光照、人文认知的不同,导致西南鬼灯檠药材产品出现一定的品质差异,生态地理环境的差异也会在植株生长过程中产生一定的影响,进而导致其植株的初生及次生代谢物的累积差异。

4.4聚类分析与主成分分析

因岩陀为民族特色药材,且在西南地区使用较为常见,故笔者总共收集了重庆与贵州两个地区的样本,样品块茎的大小不一。按照样品中各成分的含量,在聚类分析与主成分分析中将14个样品分为两大类。总的趋势上来讲,四川地区的为一类,贵州地区的为一类,因样品都产自西南地区,两地气候相近,故出现了部分样品聚类时地区交叉的现象。聚类分析和主成分分析的结果可显示两地之间的西南鬼灯檠药材质量差异不大,但是两地药材成分含量相对来讲,四川地区岩陀药材的成分含量较高。

综上所述,本研究所建UPLC-ECD指纹图谱及聚类分析和主成分分析结果可为西南鬼灯檠药材的质量控制提供参考。

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