热证是中医理论中的重要证型，病因多以阳气亢盛、热邪入血、阴气不足为主，表现为口干、发热、脉率加快等机体能量亢进的热象[1,2]。中医药治疗热证常以“热者寒之”为指导思想，研究发现神经-内分泌-免疫系统是调控其发生与发展的关键性靶标[3]，药物通过不同途径，以对神经-内分泌-免疫系统的影响为主要特征，可反映出中药作用靶点与中医证候靶点的关联性，是中医药“辨证论治”的重要体现。肠道微生态与中医证候存在密切关系[4]。张北华等[5]通过研究发现肠道菌群紊乱会导致脾虚泄泻，加重脾虚证中湿困的病理表现；黄腾杰[6]发现肠道菌群结构失调与阳虚证密切相关，并找出罗斯氏菌属等为阳虚证的特征菌属。热证状态下，宿主肠道菌群多样性的功能和结构与正常机体之间是否存在差异尚未见报道。

黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi性寒，味苦，归肺、胆、胃、大肠经，课题组前期研究将黄芩作为寒性模式中药，已证明其对热证模型大鼠物质与能量代谢及其相关生物酶具有显著的抑制作用[7]，但其是否能对神经-内分泌-免疫系统产生影响尚不明确。本研究采用IlluminaMiSeq平台的16SrRNA高通量测序技术，探讨黄芩提取物对热证模型大鼠肠道菌群多样性的变化和神经-内分泌-免疫系统的影响，对差异菌属与神经-内分泌-免疫系统相关指标进行Pearson相关性分析，旨在从肠道微生态层面揭示黄芩干预热证的作用机制，构建宿主-菌群-证候的相互作用关系，为完善中医证候评价体系奠定理论基础，并进一步诠释“热者寒之”的科学内涵。

1、材料

1.1动物

SPF级雄性SD大鼠30只，6～8周龄，体质量（180±20)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，许可证号SCXK（黑）2015-004，饲养于黑龙江中医药大学GLP实验中心，室温20～25℃，相对湿度为40%～60%，实验动物给予标准饲料和自由饮水，并获得黑龙江中医药大学伦理委员会批准（批准号DXLL2015061601）。

1.2药品与试剂

黄芩（批号20140623）购自河北承德药材有限公司，经黑龙江中医药大学中药资源教研室王振月教授鉴定为唇形科植物黄芩S.baicalensisGeorgi的干燥根；左甲状腺素钠片（批号H20160056，规格50μg/片）购自德国默克-里昂制药公司；大鼠去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）酶联免疫试剂盒、大鼠5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）酶联免疫试剂盒、大鼠多巴胺（dopamine,DA）酶联免疫试剂盒、大鼠促甲状腺激素（thyrotropin,TSH）酶联免疫试剂盒、大鼠促甲状腺激素释放激素（thyrotropin-releasinghormone,TRH）酶联免疫试剂盒、大鼠促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropichormone,ACTH）酶联免疫试剂盒、大鼠促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin-releasing-hormone,CRH）酶联免疫试剂盒、大鼠17-羟皮质类固醇（17-hydroxycorticosteroids,17-OHCS）酶联免疫试剂盒、大鼠白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2）酶联免疫试剂盒、大鼠白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6）酶联免疫试剂盒、大鼠白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10）酶联免疫试剂盒、大鼠γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）酶联免疫试剂盒，批号均为20160816，购自南京建成生物工程研究所；大鼠饲料购自北京科澳协力饲料有限公司。

1.3仪器

FLx800型多功能酶标仪（美国BioTek公司）；RS232G型紫外分光光度计（德国Eppendorf公司）；AUT0520型凝胶成像系统、32RL117950型综合式紫外分析仪（美国BG公司）；Pico17型离心机（美国Thermo公司）；QuantiFluorTBS380型荧光计（美国Promega公司）。

2、方法

2.1黄芩提取物的制备

黄芩饮片浸泡30min，分别加入10倍量和8倍量的蒸馏水提取，合并2次提取液，冷凝回流2h，减压回收提取液，真空冻干制成干燥粉末（经HPLC测得黄芩苷质量分数为12.87%，黄芩素质量分数为0.51%，汉黄芩苷质量分数为3.36%，汉黄芩素质量分数为0.28%），存放于干燥器内备用。

2.2动物分组、造模与给药

大鼠适应性饲养3d后，按照体质量均衡分配原则，随机分为对照组、模型组、黄芩提取物（3g/kg）组，每组10只[8]。左甲状腺素钠片研磨至粉末，溶于饮用水配制成质量浓度为0.04g/mL的溶液；黄芩提取物冻干粉溶于饮用水配制成质量浓度为1g/mL的混悬液。每天9:00时对照组ig饮用水（10mL/kg），其余各组大鼠ig左甲状腺素钠混悬液（0.12g/kg)[9]；自造模开始，每天10:00时黄芩提取物组ig黄芩提取物（10mL/kg），对照组、模型组ig等体积饮用水，连续15d。

2.3体征指标检测

每天给药前记录大鼠饮水量和体质量的变化，于给药第0、5、10、15天检测并记录大鼠肛温。

2.4样本收集与处理

末次给药24h后，大鼠ip20%乌拉坦麻醉，腹主动脉取血，常温静置30min,4℃、3500r/min离心10min，取上清液，于-80℃冰箱保存备用。

每组随机选取5只大鼠，脱颈椎处死后取盲肠部位内容物于无菌离心管中，迅速冻存于液氮中，立即转存于-80℃冰箱，用于肠道菌群多样性的分析。

2.5肠道菌群多样性分析

采用IlluminaMiSeq测序平台，选用16SrRNAV4可变区的通用引物进行扩增，引物序列长度为280bp，前引物为5’-AYTGGGYDTAAAGNG-3’，后引物为5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3’,98℃预变性30s，变性15s,50℃退火30s，循环25次，72℃延伸30s,72℃最终延伸5min,4℃终止保存。扩增结果用凝胶回收试剂盒回收片段。在IlluminaMiSeq平台应用文库检测和定量试剂盒对PCR产物进行定量分析，制备试剂盒与高灵敏度DNA检测试剂盒进行建库，MiSeq试剂盒循环2×300bp进行双端测序。采用QIIME软件、R软件、Mothur软件对测序结果进行可视化分析。

2.6血清指标检测

按照酶联免疫试剂盒说明书分别检测大鼠血清中NE、5-HT、DA、TSH、TRH、ACTH、CRH、17-OHCS、IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ水平。

2.7数据处理

各组实验数据均用SPSS20.0统计软件做统计学处理，结果符合正态分布者以s表示，对数据进行单因素方差分析，组间比较方差齐时用最小显著差异进行检验，方差不齐时，两两比较采用Dunnett’s检验。

3、结果

3.1黄芩提取物对热证模型大鼠体征指标的影响

如图1所示，第15天，与对照组比较，模型组大鼠肛温升高，饮水量和体质量显著增加（P<0.01）；与模型组比较，黄芩提取物组大鼠肛温降低，饮水量和体质量显著降低（P<0.01），表明黄芩提取物能够明显改善热证模型大鼠一般体征的变化。

图1黄芩提取物对热证模型大鼠肛温(A)、饮水量(B)和体质量(C)的影响

3.2黄芩提取物对热证模型大鼠血清指标的影响

如表1～3所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中NE、DA、TSH、TRH、CRH、ACTH、17-OHCS、IL-2、IFN-γ水平显著升高（P<0.05、0.01),5-HT、IL-6、IL-10水平显著降低（P<0.01）；与模型组比较，黄芩提取物组大鼠NE、DA、TSH、TRH、CRH、ACTH、17-OHCS、IL-2、IFN-γ水平显著降低（P<0.05、0.01),5-HT、IL-6、IL-10水平显著升高（P<0.01）。

3.3肠道菌群分类操作单元（operationaltaxonomicunits,OTUs）与多样性分析

如图2所示，与对照组比较，模型组大鼠肠道菌群门、纲、目、科、属、种6类OTUs地位丰度明显增加；与模型组比较，黄芩提取物组大鼠肠道菌群门、纲、目、科、属、种6类OTUs地位丰度在一定程度上均有所减少。如图3所示，随着样本数量增加，肠道菌群数量会趋于某一恒定值，表明测序深度充分，Specaccum物种累积曲线能足够反映群落丰度水平。α多样性分析结果如表4所示，与对照组比较，模型组大鼠肠道菌群丰度指数（Chao1、ACE）与多样性指数（Simpson、Shannon）显著升高（P<0.01）；与模型组比较，黄芩提取物组大鼠肠道菌群丰度指数与多样性指数显著降低（P<0.01）。采用主成分分析（principalcomponentanalysis,PCA）考察大鼠肠道菌群β多样性的差异，如图4所示，模型组与对照组大鼠肠道菌群明显分开，表明2组菌群结构具有显著性差异；黄芩提取物组大鼠肠道菌群趋向对照组，表明黄芩提取物组肠道菌群结构与对照组相近，两者可能存在一定的亲缘关系。

表1黄芩提取物对热证模型大鼠神经系统递质水平的影响

表2黄芩提取物对热证模型大鼠内分泌系统相关指标水平的影响

表3黄芩提取物对热证模型大鼠免疫系统相关指标水平的影响

图2大鼠肠道菌群的OTUs分析

图3大鼠肠道菌群的Specaccum物种累积曲线

3.4肠道菌群组成与结构分析

如图5所示，在门水平，与对照组比较，模型组大鼠肠道菌群具有显著性差异的菌门有6个（P<0.05、0.01），拟杆菌门（Bacteroidetes）、螺旋菌门（Spirochaetes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）上调，厚壁菌门（Firmicutes）、梭杆菌门（Fusobacteria）下调；黄芩提取物组可显著性回调这6个菌门（P<0.05、0.01）。如图6、7所示，在属水平，通过对差异菌门中排前50的优势菌属进行聚类分析，将具有共同差异性菌属的位置在系统发育树中标注，分别是奇异菌属Atopobium、球杆菌属Aggregatibacter、布劳特氏菌属Blautia、拟杆菌属Bacteroides、克里斯滕森菌属Christensenella、梭菌属Clostridium、柯林斯菌属Collinsella、棒状杆菌属Corynebacterium、粪芽孢菌属Coprobacillus、粪球菌属Coprococcus、多尔氏菌属Dorea、梭杆菌属Fusobacterium、螺杆菌属Helicobacter、气球菌属Aerococcus、颤螺旋菌属Oscillospira、苍白杆菌属Ochrobactrum、狄氏副拟杆菌属Parabacteroides、考拉杆菌属Phascolarctobacterium、帕拉普氏菌属Paraprevotella、普雷沃菌属Prevotella、罗斯氏菌属Rothia、瘤胃球菌属Ruminococcus、萨特氏菌属Sutterella、葡萄球菌属Staphylococcus、密螺旋体菌属Treponema。如图8所示，与对照组比较，模型组大鼠肠道菌群具有显著性差异的菌属有25个（P<0.05、0.01），其中17种菌属上调，8个菌属下调。与模型组比较，黄芩提取物组可显著性回调这25个菌属（P<0.05、0.01）。

表4各组大鼠肠道菌群的多样性指数与丰度指数

图4各组大鼠样本菌群β多样性分析

图5大鼠菌群具有显著性差异水平的菌门分布

3.5差异肠道菌群关联性分析

应用Pearson相关系数分析法，探究黄芩提取物干预热证模型大鼠血清相关指标的过程中差异肠道菌群与神经-内分泌-免疫系统的联系，当|r|>0.5且P<0.05，表示两者之间存在显著相关性；当|r|>0.8，表示两者之间具有强相关性。如图9、10所示，神经系统与普雷沃菌属、柯林斯菌属、多尔氏菌属关联性较强；免疫系统与普雷沃菌属、柯林斯菌属、螺杆菌属、萨特氏菌属、葡萄球菌属、克里斯滕森菌属、苍白杆菌属关联性较强；内分泌系统与瘤胃球菌属、柯林斯菌属、拟杆菌属、梭菌属、球杆菌属、葡萄球菌属、苍白杆菌属关联性较强。表明黄芩提取物不仅能改善肠道菌群多样性，同时也能回调神经-内分泌-免疫系统的关键指标。

图6各组大鼠菌群优势菌属的群落分类丰度分布热分析

图7各组大鼠样本菌群差异菌属的系统等级分析

图8各组大鼠样本具有显著性差异的肠道菌群

图9差异菌群与血清指标相关性的热分析

图10黄芩提取物调节热证模型大鼠差异肠道菌群与神经-内分泌-免疫系统的关联性分析

4、讨论

热证在中医临床中是一个复杂而综合的统称，中医辨证一般将其分为实热证与虚热证，与相应的病变部位或病因相结合产生规范的评价与量化的诊断标准[1]。左甲状腺素钠，又称为优甲乐，临床常用于治疗由各种原因引起的甲状腺功能减退，可促进机体各组织与器官氧化反应[10]，饮水量、体质量、体温变化是其一般体征的直观表现[11]。DA、5-HT、NE是中枢神经系统中重要的神经递质，可调控交感神经系统与脊髓神经系统的功能，是大脑内部兴奋活动的重要体现[12];CRH、ACTH、17-OHCS是参与下丘脑与垂体的关键性肾上腺皮质激素，与TRH、TSH共同作用于内分泌系统中下丘脑-垂体-促甲状腺素轴的调节，是中医热证形成物质与能量代谢亢进的表现[13]。中医热证免疫系统会加速消耗免疫系统，T淋巴细胞的转化率增加，造成CD4+T细胞中的IL-2、IFN-γ与CD8+T中的IL-6、IL-10水平失调，导致炎症因子水平升高、抗炎因子水平降低[14,15]。结合饮食量、肛温与体质量相关数据分析，本研究结果显示热证状态下机体的各个系统均处于兴奋水平，黄芩提取物对热证模型大鼠神经-内分泌-免疫系统中的关键指标均起到调节作用，表明黄芩提取物能从整体出发改善神经-内分泌-免疫系统和相应体征，是中医“热者寒之”的价值体现。

肠道微生态系统在人体中处于动态平衡，当受到外界的干预或刺激后，菌群稳态被打破，在不断变化中恢复原先相关肠道菌群的组成与结构的功能，通过对菌群微生态相关指标的评价，能反映出药物对疾病治疗的效果[16,17]。本研究发现黄芩提取物可显著回调具有差异的6个菌门与25个菌属。拟杆菌门与厚壁菌门之和占人体细菌总数量的90%以上，Gulas等[18]通过对厚壁菌门与拟杆菌门相对比例的研究发现，肠道内容物中拟杆菌门与厚壁菌门的比例大于正常值时，将加速肠内微生物对食物中热量的有效吸收，促进机体能量代谢与物质代谢的速率；放线菌门（主要以双歧杆菌为主）和变形菌门（主要以肠杆菌为主）属于中性菌属，若肠道内微环境遭到破坏，会变成带有侵袭性或致病性菌群迁移到身体其他部位，造成相关组织或系统的病变[19]。本研究结果显示黄芩提取物可改善热证大鼠模型中拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门与变形菌门的数量，促进紊乱的肠道微环境恢复正常的动态平衡与稳态，本研究将肠道微生态作为整体，体现出中药黄芩对热证治疗的“整体观”思想。螺旋菌门与梭杆菌门为宿主内的微量菌门，随着生物领域技术的不断发展，其相应的菌物学意义有待于进一步探索。

联合差异菌属与神经-内分泌-免疫系统关键指标的分析结果发现，柯林斯菌属对免疫系统、中枢神经系统与内分泌系统均有强相关作用。柯林斯菌属是一种产气菌属，可促进β-类固醇脱氢酶的产生，加快体内熊去氧胆酸的合成，提高机体物质与能量代谢的转化效率，增强机体抗氧化能力及免疫功能[20,21]；普雷沃菌属为拟杆菌门不产芽孢的厌氧菌属，主要代谢产物为乙酸、琥珀酸和少量丁酸[22]，能促进神经鞘脂类递质的产生，影响免疫系统和神经系统的反馈调节[23,24]；苍白杆菌属是一种条件致病菌属，对免疫功能低下者具有强感染能力，可造成自身免疫应答反应过激、内分泌系统代谢紊乱等现象[25,26]。本研究结果表明，黄芩提取物对25种差异菌属和神经-内分泌-免疫系统轴的关键指标具有显著回调能力，表明中药具有多靶点、多途径的特点，更体现出中医药治疗“整体观”的思维。

综上所述，黄芩提取物可有效改善热证大鼠模型肠道菌群多样性和神经-内分泌-免疫系统的变化，通过16SrRNA高通量测序技术可建立对中医证候评价体系，对相关中药及复方用于此类中医证候研究具有深远的指导意义。肠道微生态变化不仅会对机体肠道菌群多样性产生影响，还会对相关组织细胞中蛋白质合成或转录因子引起反馈效应，课题组后续将联合多组学技术和整合药理学方法，对“热者寒之”的科学内涵进行更深入的诠释。

参考文献：

[1]赵洪伟,张宁,庞牧,等.玄参及其拆分组分对热证大鼠物质与能量代谢的影响[J].中药药理与临床,2017,33(6):93-96.

[3]梁月华.寒､热证本质研究回顾及展望[J].中国中西医结合杂志,2019,39(4):397-404.

[4]顾宁宁,张兴德,郁红礼,等.基于16SrRNA基因测序的黄连对2型糖尿病大鼠肠道微生物多样性影响研究[J].中草药,2017,48(19):3998-4004.

[5]张北华,王凤云,卞兆祥,等.证候表型与肠道微生态的相关性[J].中医杂志,2018,59(1):21-25.

[6]黄腾杰.阳虚质肠道菌群结构特征研究[D].北京:北京中医药大学,2015.

[7]张亚男,陈平平,王洪玉,等.黄芩拆分组分寒热药性归属[J].辽宁中医药大学学报,2017,19(12):32-36.

[8]高鑫,陈平平,王喆,等.基于大鼠机体能量代谢生物标志物变化的黄芩药性研究[J].中华中医药杂志,2018,33(5):2031-2036.

[9]陈平平,张亚男,王喆,等.基于蛋白组学方法研究黄芩对热证大鼠物质能量代谢的影响[J].中药药理与临床,2018,34(5):90-96.

[10]张宁,李自辉,赵洪伟,等.基于尿液代谢组学研究玄参对阴虚火旺甲亢大鼠的滋阴降火作用机制[J].药学学报,2018,53(11):1843-1851.

[11]张宁,李自辉,赵洪伟,等.玄参提取物对甲亢模型大鼠肝脏代谢组学的影响[J].北京中医药大学学报,2019,42(1):21-29.

[12]王瑞生,张振凌,陈祎甜,等.基于寒热证模型大鼠研究五倍子发酵百药煎的药性变化和归属[J].中国中药杂志,2019,44(10):2084-2089.

[13]张宏伟,王嘉琪,张婕,等.关黄柏醇提部位化学拆分组分分析及其对热证大鼠的影响[J].中国实验方剂学杂志,2017,23(10):29-33.

李自辉,陈平平,王宇,张亚男,吴娟,刘树民.基于高通量测序技术的黄芩提取物对热证模型大鼠肠道菌群多样性的影响[J].中草药,2021,52(02):422-431.

基金:国家重点基础研究发展“973”计划项目(2013CB531804);黑龙江省自然科学基金联合引导项目(LH2020H099)