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羟基红花黄色素A对糖氧剥夺后bEnd.3细胞自噬作用的影响

2024-07-01 70 上传者：管理员

摘要：目的探究羟基红花黄色素A(HSYA)对糖氧剥夺(OGD)后bEnd.3细胞自噬作用的影响及机制。方法将bEnd.3细胞分为正常组(常规培养)、模型组(OGD模型)、HSYA组(OGD模型+75μmol•L-1 HSYA)、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3MA)抑制药组(5 mmol•L-1 3MA+OGD模型)、3MA+HSYA组(5 mmol•L-1 3MA+OGD模型+75μmol•L-1 HSYA)。用TUNEL荧光染色法测定细胞凋亡水平；用蛋白质印迹法测定自噬、血脑屏障(BBB)相关蛋白的表达水平；用实时荧光定量聚合酶链反应法测定沉默信息调节因子1(SIRT1)、人叉头蛋白O3A(FOXO3A)mRNA的表达水平。结果正常组、模型组、HSYA组、3MA抑制药组和3MA+HSYA组中TUNEL染色阳性细胞分别为5.00±1.00、28.00±2.00、21.00±3.00、35.33±2.51和29.67±2.52;微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ/-Ⅰ(LC3-Ⅱ/-Ⅰ)表达水平分别为0.90±0.20、1.34±0.10、1.95±0.14、0.76±0.15和1.14±0.09;泛素结合蛋白P62(P62)表达水平分别为0.99±0.02、0.60±0.02、0.38±0.01、0.67±0.04和0.54±0.01;闭合蛋白(Occludin)表达水平分别为1.39±0.17、0.62±0.15、1.00±0.09、0.40±0.13和0.80±0.15;紧密连接蛋白1(ZO-1)表达水平分别为1.63±0.20、0.64±0.06、0.98±0.14、0.37±0.14和0.87±0.04;SIRT1 mRNA表达为1.00±0.00、0.75±0.07、1.69±0.09、0.31±0.02和0.56±0.01;FOXO3A mRNA表达为1.00±0.00、0.80±0.05、1.47±0.09、0.40±0.01和0.62±0.09。模型组与正常组比较，HSYA组与模型组比较，3MA+HSYA组与3MA抑制药组比较，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。结论 HSYA可能通过SIRT1/FOXO3A通路增强OGD后bEnd.3细胞自噬水平，抑制细胞凋亡减轻BBB损伤。

关键词：
bEnd.3细胞
沉默信息调节因子1/人叉头蛋白O3A通路
糖氧剥夺
羟基红花黄色素A
自噬
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缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke, CIS)是全球残疾和死亡的第二大原因，严重危害人类健康和生活质量[1]。自噬是一种能够将受损细胞器或错误折叠蛋白通过溶酶体系统进行降解并回收的复合分子途径[2]。CIS发生后，脑血管内皮细胞自噬激活，并参与维护或破坏血脑屏障(blood brain barrier, BBB)的稳态，从而保护或加重CIS后脑组织损伤[3]。羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A, HSYA)可参与调控自噬水平。研究发现，HSYA可通过激活SH-SY5Y细胞自噬，抑制神经元细胞凋亡，发挥神经保护作用[4]。然而，HSYA对脑血管内皮细胞自噬是否发挥作用，其相关机制尚未明确。本实验旨在探索HSYA对脑血管内皮细胞自噬的影响，以期从自噬的角度探讨HSYA对脑缺血损伤后脑血管内皮细胞的保护机制，为CIS提供新的治疗靶点。

1、材料与方法

1材料

细胞小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3),购自北京北纳生物公司。

药物与试剂HSYA,规格：每瓶20 mg,纯度：≥98.0%,批号：ST02370120,购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3MA),规格：每瓶100 mg,含量：≥99.0%,购自德国Sigma-aldrich公司。微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)、泛素结合蛋白P62(sequestosome 1, SQSTM1/P62)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2-Associated X凋亡蛋白(Bcl-2-associated X, Bax)、活化型半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved-Caspase 3)、人叉头蛋白O3A(forkhead box protein O3a, FOXO3A)、闭合蛋白(Occludin)抗体，均购自美国Abcam公司；紧密连接蛋白1(zonula occludens-1, ZO-1)抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司；沉默信息调节因子1(sirtuin-1, SIRT1)抗体，购自武汉三鹰生物技术有限公司；Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒，购自上海汉恒生物科技有限公司；一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(绿色荧光),购自碧云天生物科技有限公司。SIRT1、FOXO3A、LC3和Tubulin基因引物，均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

仪器Bugbox M厌氧工作站，英国Baker Ruskinn公司产品；1645050电泳仪、1658001电泳槽、12003153 ChemiDocTouch化学发光成像系统，均为美国BIO-RAD公司产品；DM4000B正置荧光显微镜，德国Leica公司产品。

2实验方法

2.1细胞培养与模型构建

将bEnd.3细胞培养于盛有含10%胎牛血清、1%双抗的新鲜完全培养基的T75培养瓶中，传代，并用于后续实验。按照文献[5]方法进行细胞糖氧剥夺(oxygen-glucose deprivation, OGD)模型的建立，体外模拟脑缺血环境时间为6 h。

2.2细胞分组与给药

将生长状态良好的bEnd.3细胞分为正常组、模型组、HSYA组、3MA抑制药组、3MA+HSYA组。除正常组常规培养外，其余各组均置于厌氧箱6 h进行OGD模型的建立。模型组加入缺氧培养基；HSYA组加入为含终浓度为75μmol·L-1 HSYA的缺氧培养基；3MA抑制药组提前4 h加入5 mmol·L-1 3MA进行预处理，并在缺氧培养基中加入5 mmol·L-1 3MA;3MA+HSYA组加入为含终浓度为75μmol·L-1 HSYA的缺氧培养基，并使用5 mmol·L-1 3MA进行处理。

2.3四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法[6]6]和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)法[7]7]测定HSYA最佳药物浓度

将生长状态良好的bEnd.3细胞，消化，离心，重悬，并接种至96孔培养板，每孔180μL。将1、5、25、75、125、150μmol·L-1浓度的HSYA加入96孔培养板中(每孔20μL),放入厌氧箱中OGD 6 h后取出弃上清，轻柔清洗后按照文献所述进行MTT检测。细胞存活率=(ODHSYA组-OD空白组)/(OD模型组-OD空白组)×100%。将加入各浓度HSYA的bEnd.3细胞放入厌氧箱OGD 6 h后，收集细胞培养上清液，用LDH试剂盒测定LDH含量，以此分析说明细胞的损伤程度。

2.4实时荧光定量聚合酶链反应法测定SIRT1和FOXO3A的mRNA表达水平

提取各组细胞总RNA,按说明书及文献[7]方法进行逆转录合成cDNA,扩增，用2-ΔΔCt计算mRNA相对表达水平。

2.5蛋白质印迹法测定相关目的蛋白表达情况[8]8]

提取各组细胞总蛋白并定量。用一步法PAGE凝胶快速制备试剂盒制胶，上样，电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗、二抗孵育。待二抗孵育完毕，用吐温20% Tris盐缓冲液进行洗膜，最后进行发光显色观察相关指标，并使用软件Image J进行测量分析。

2.6 Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染法测定细胞自噬通量[9]9]

取生长状态良好的bEnd.3细胞，消化，离心，重悬，加入已放置好玻璃爬片的24孔板中(每孔500μL,1.5×105个细胞),培养至细胞贴壁，加入腺病毒和新鲜完全培养基每孔250μL,4 h后补足至每孔500μL。感染6～8 h后弃上清，加入新鲜完全培养基继续培养。12 h后，进行药物干预后OGD处理6 h,取出进行固定，封片，拍照，计数。

2.7一步法TUNEL细胞凋亡检测法测定细胞凋亡情况[10]10]

取生长状态良好的bEnd.3细胞，消化，离心，将玻璃爬片置于24孔板中，重悬细胞后接种至24孔板中(每孔500μL,1.5×105个细胞),培养至细胞贴壁。24 h后，进行HSYA和5 mmol·L-1 3MA干预后OGD处理6 h,取出，轻柔清洗，细胞固定，按照说明书所述进行TUNEL染色。最后，在荧光显微镜下拍摄照片。

3统计学处理

用GraphPadPrism 8.0软件进行统计分析。用单因素方差分析ANOVE评估对各组数值进行比较，计量资料以

2、结果

1 HSYA作用于bEnd.3细胞的最佳药物浓度

bEnd.3细胞中分别加入终浓度为0、1、5、25、75、125、150μmol·L-1 HSYA,并进行常氧和OGD处理，MTT测得常氧情况下细胞活力分别为(100.00±0.00)%、(101.31±2.84)%、(104.65±4.73)%、(108.38±5.66)%、(116.68±7.55)%、(97.72±12.05)%、(101.20±11.56)%;经OGD处理后细胞活力分别为(100.00±0.00)%、(126.26±8.88)%、(151.72±3.52)%、(172.56±8.47)%、(204.90±21.25)%、(177.23±4.26)%、(173.42±3.00)%。经OGD处理后，各组LDH释放量为8.68±0.40、18.17±1.55、15.95±0.30、16.33±0.85、12.88±1.41、14.32±0.52和13.60±1.86。结果表明，75μmol·L-1的HSYA为最佳药物浓度。

2 HSYA可抑制OGD后bEnd.3细胞凋亡减轻BBB损伤

正常组给予常规培养；模型组构建OGD模型；HSYA组构建OGD模型+75μmol·L-1 HSYA。

模型组与正常组比较，Bcl-2、Bax和Cleaved-Caspase 3的蛋白相对表达水平均显著升高，Occludin和ZO-1蛋白相对表达水平均显著降低(P<0.05, P<0.01);HSYA组与模型组比较，Bcl-2、Occludin和ZO-1表达水平均显著升高，Cleaved-Caspase 3和Bax蛋白相对表达水平均显著降低(P<0.05, P<0.01),见表1。

3 HSYA可诱导OGD后bEnd.3细胞自噬

正常组、模型组、HSYA组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ分别为0.76±0.05、1.15±0.12、1.58±0.08,P62蛋白相对表达水平分别为1.21±0.12、0.69±0.14、0.35±0.09。模型组与正常组比较，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著升高，P62蛋白相对表达水平显著下降(P<0.05,P<0.01);HSYA组与模型组比较，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著升高，P62蛋白相对表达水平显著下降(P<0.05,P<0.01);Ad-mCherry-GFP-LC3B自噬双标腺病毒感染后红色斑点数量分别为6.67±1.52、47.33±4.93、116.00±12.12;黄色斑点数量分别为13.00±1.63、37.33±3.30、85.00±4.90。模型组与正常组比较，HSYA组与模型组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05),表明HSYA干预后进一步激活了自噬，自噬流水平升高。

表1羟基红花黄色素A(HSYA)对糖氧剥夺(OGD)后bEnd.3细胞凋亡和血脑屏障(BBB)的影响

4 HSYA可通过调节OGD后bEnd.3细胞自噬抑制细胞凋亡、BBB损伤

正常组给予常规培养；3MA抑制药组给予5 mmol·L-1 3MA+OGD模型；3MA+HSYA组给予5 mmol·L-1 3MA+OGD模型+75μmol·L-1 HSYA。

模型组与正常组比较，HSYA组与模型组比较，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62、Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase 3、Occludin和ZO-1蛋白相对表达水平差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.001);3MA+HSYA组与3MA抑制药组比较，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62、Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase 3、Occludin和ZO-1蛋白相对表达水平差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.001),见表2。正常组、模型组、HSYA组、3MA抑制药组和3MA+HSYA组中TUNEL染色阳性细胞分别为5.00±1.00、28.00±2.00、21.00±3.00、35.33±2.51和29.67±2.52。模型组与正常组比较，HSYA组与模型组比较，3MA+HSYA组与3MA抑制药组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05),见图1。

表2 HSYA对OGD后bEnd.3细胞自噬的调节以及对细胞凋亡和BBB的影响

图1 HSYA对OGD后bEnd.3细胞凋亡的影响(×100)

表3 HSYA对OGD后bEnd.3细胞沉默信息调节因子1/人叉头蛋白O3A(SIRT1/FOXO3A)表达的影响

5 HSYA可通过SIRT1/FOXO3A信号通路促进OGD后bEnd.3细胞自噬

模型组与正常组比较，SIRT1、FOXO3A mRNA和蛋白表达降低，LC3 mRNA表达增加，差异均有统计学意义(P<0.05, P<0.01, P<0.001);HSYA组与模型组比较，SIRT1、FOXO3A mRNA、蛋白和LC3 mRNA表达均显著增加，差异均有统计学意义(P<0.001);3MA+HSYA组与3MA抑制药组比较，SIRT1、FOXO3A、LC3 mRNA表达均显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05, P<0.01, P<0.001),见表3。

3、讨论

HSYA可减轻脑卒中后脑组织的病理损伤，维护BBB的完整性，但其作用机制尚未明确[11]。本研究结果显示，HSYA能够降低OGD后bEnd.3细胞凋亡水平和BBB相关蛋白降解，表明HSYA能够对bEnd.3细胞发挥保护作用，且有利于维持BBB的完整性。

自噬在CIS的发生发展中具有双向作用，已成为治疗CIS的新策略，调节自噬水平可减轻脑缺血损伤[12]。本实验发现，HSYA可诱导OGD后bEnd.3细胞自噬。本课题组推测HSYA诱导的自噬可抑制bEnd.3细胞凋亡减轻BBB损伤，而OGD后自噬虽被激活，但其激活程度不足以抑制细胞凋亡。因此，使用自噬抑制药3MA进行验证，本实验发现，HSYA干预后自噬水平进一步增加，凋亡水平和BBB损伤降低，而在加入自噬抑制药3MA后，逆转了这一结果。自噬的诱导参与了HSYA对bEnd.3细胞OGD损伤的保护机制。

SIRT1/FOXO3A信号通路是一条调控自噬的重要通路，在自噬诱导中起关键作用[13]。本实验结果发现，HSYA作用后SIRT1、FOXO3A蛋白、RNA和LC3 RNA表达均增加，表明HSYA可能通过激活SIRT1/FOXO3A通路促进bEnd.3细胞自噬。

参考文献:

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基金资助:国家自然科学基金资助项目(82004028,81473577);中国博士后科学基金面上资助项目(2020M680912);山西省科技创新人才青年团队基金资助项目(202204051001028);山西省卫健委医学科技领军团队基金资助项目(2020TD05);山西省研究生科研创新基金资助项目(2023KY677);山西中医药大学2022年度科技创新团队基金资助项目(2022TD2010);山西中医药大学基地平台开放课题资助项目(2022JD-KF-19);山西中医药大学学科建设经费(2023XKJS—02);山西中医药大学研究生教育创新计划基金资助项目(2023CX024);

文章来源:戴瑶瑶,舒梦琦,魏汝恒,等.羟基红花黄色素A对糖氧剥夺后bEnd.3细胞自噬作用的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(12):1734-1738.