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高效液相色谱法测定美罗培南血药浓度在个体化用药中的应用

2024-08-08 253 上传者：管理员

摘要：目的建立高效液相色谱法测定美罗培南血药浓度的分析方法。方法采用安捷伦配套经典C18色谱柱(5μm, 250 mm×4.6 mm),流动相使用pH为±5的含三乙胺水溶液—乙腈(92∶8),检测波长为220 nm。血清样品用二氯甲烷萃取。结果美罗培南血药浓度线性范围为0.70～50.00μg/ml(r=0.999 31),最低检测浓度为0.70μg/ml,方法回收率为101.40%～109.00%,萃取回收率为68.60%～71.30%。结论该方法简便、灵敏、稳定，可以用于检测患者血清中美罗培南的血药浓度，实现患者个体化用药。

关键词：
液—液萃取
碳青霉烯类
美罗培南
血药浓度
高效液相色谱法
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美罗培南是经典的碳青霉烯类抗菌药物，在治疗多重耐药的革兰阴性杆菌引起的感染方面有很好的抗感染效果，《中国中性粒细胞缺乏伴发热患者抗菌药物临床应用指南(2016年版)》[1]指出有持续性发热但无明确来源，且心、脑供血不足患者，应首选美罗培南或亚胺培南；在《中国腹腔感染诊治指南(2019版)》[2]中也明确指出在初始的抗生素治疗中应首选具有抗革兰阴性菌活性的广谱抗生素美罗培南等；另外在需要入住重症监护室的重症肺炎患者的抗生素治疗中，美罗培南也被一线推荐。但受患者自身生理病理状态的影响，导致该药仅凭经验性用药效果不佳；而采用治疗药物监测的方法辅助给药方案的制定，可改善临床治疗结局，减缓耐药，提高用药合理性。对于严重肾功能不全的患者，不同透析模式因滤过膜的材料、面积、吸附性及透析液流速等因素的不同，使同一剂量的美罗培南血药浓度有很大差异，因此对使用美罗培南治疗的重症患者进行药物监测意义重大。有文献报道，高效液相色谱法可用于监测人体内美罗培南的血药浓度[3]。本文参考并优化了文献方法来实现美罗培南的血药浓度监测，用于研究受试者静脉滴注美罗培南后体内的血药浓度，为研究美罗培南在人体内药代动力学试验提供测定方法。

1、仪器及试剂

1.1仪器

Agilent1260高效液相色谱系统(G7129A四元泵，G7114A紫外检测器，G7129- 60080自动进样器，G7116A柱温箱及其工作站),SIGMR-3K15低温高速离心机(12154转子),SB-5200D超声波清洗机，LDZ4K型恒温低速离心机，Vortex-M振荡器(上海沪析实业公司),药品阴凉柜(美百加),BC/BD-101HBZ-20°冰柜，AT201型十万分之一电子天平。

1.2试剂

美罗培南标准品(深圳市海滨制药有限公司提供，批号130506,含量97.4%),乙腈、甲醇为色谱纯，三乙胺、磷酸为分析纯。经0.22μm微孔滤膜过滤的纯化水。流动相为含三乙胺的水溶液(用磷酸调节pH为±5.0)—乙腈(92∶8)[4];检测波长：因我院现有仪器不能实现全波长扫描，故参考现有文献中安捷伦仪器监测美罗培南方法中的吸收波长，逐一试验，发现在220 nm处吸收最大，峰型较好，无干扰杂峰，最终确定波长为220 nm;流速1 ml/min。

2、方法与结果

2.1色谱条件

安捷伦配套经典C18色谱柱(5μm, 250 mm×4.6 mm),柱温、自动进样器温度均为30℃,进样量10 ml。

2.2标准品溶液制备

精密称取美罗培南标准品0.005 g,甲醇溶解定容至100 ml的容量瓶，使成500μg/ml的储备液，备用。

2.3血清预处理及测定

抽取患者血样2～3 ml于EDTA采血管中，用LDZ4K型恒温低速离心机4 000 r/min离心5 min,精密吸取血浆样品200μl,加乙腈400μl,震荡1 min,离心5 min,吸取全部上清液，加二氯甲烷600μl,震荡1 min,离心5 min,取上层水相进样(注意不要戳破油膜),然后进样分析。在选定的色谱条件下，美罗培南的出峰时间为8.807 min,测得的色谱图见图1,样品峰峰形良好，分离完全，无杂质峰干扰。

图1人血清中美罗培南高效液相色谱图

2.4标准曲线的制备

用空白血清将储备液依次稀释成50.0、25.0、12.50、6.250、3.125、1.562 5、0.781 25μg/ml系列浓度，按照“2.3”中血清预处理方法处理后进样分析，得到以峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归的美罗培南标准曲线回归方程：Y=5.903 317 31X+3.376 898 9(r=0.999 31),检测范围：0.70～50.00μg/ml,最低检测浓度为0.7μg/ml。

2.5线性关系

取标准品溶液，采用逐级稀释法制成50.0、25.0、12.50、6.250、3.125、1.562 5、0.781 25μg/ml的系列标准溶液。取标准浓度的各系列标准品溶液，上机进样。以浓度和峰面积为坐标轴，进行线性回归分析，见图2。表明主成分在线性范围内线性关系良好，相关系数均符合规定。

图2美罗培南线性关系图

2.6方法学验证

方法回收率及萃取回收率试验：用空白血清和美罗培南标准储备液配制，使成50.0、25.0、12.50、6.250、3.125、1.562 5、0.781 25μg/ml 7个浓度的系列样品。另外，在空白血清中加入美罗培南储备液适量，使成浓度为16.67、5.55、1.85μg/ml的高、中、低质控品。按照“2.3”中血清预处理方法处理后进样，每个点各进样5次，用标准曲线算出各质控样品的浓度，计算方法的回收率。另外同法配制美罗培南的系列质控溶液，经二氯甲烷萃取测定，将上述美罗培南的系列质控溶液直接用乙腈沉淀，不经二氯甲烷萃取分析，每个质控溶液分别进样5次，将两组样品的峰面积用标准曲线算相应的浓度后对比，计算美罗培南的萃取回收率，见表1。

表1美罗培南方法回收率及萃取回收率

2.7稳定性

2.7.1冻融稳定性：

用空白血清稀释美罗培南标准溶液，使成50.0、25.0、12.50、6.250、3.125、1.562 5、0.781 25μg/ml 7个浓度的样品，放入-20℃冰箱中，另外，在空白血清中加入美罗培南储备液适量，使成浓度为16.67、5.55、1.85μg/ml的高、中、低质控品放入-20℃冰箱中，分别在1、5、10 d取出，冻融，按“2.3”中血清预处理方法处理后进样，测定，3次的回收率为2.8%～4.4%。

2.7.2室温稳定性：

用空白血清稀释美罗培南标准溶液，使成16.67、5.55、1.85μg/ml浓度的样品，按“2.3”血清预处理方法处理后由自动进样器自动进样，因美罗培南血样在室温下长时间存放会产生降解，所以选择分别在0、2、4、8、10 h测定，5次的回收率为3.8%～8.6%。

2.8在临床实践中的应用

本方法采用陈文倩老师开发的碳青霉烯类药物f%T>MIC计算模型，通过测定美罗培南第五剂药物在给药前3 h和给药前30 min的血药浓度，计算大于MIC的时间百分比，评价给药方案的达标情况，优化个体化的给药方案。给药方案f%T>MIC达标情况评价：明确病原菌后，针对美罗培南的两个血药浓度值，根据以上计算模型计算，获得病原菌对应的f%T>MIC水平，对于普通患者以40%为评价靶值，对于重症患者以70%为评价靶值，对于不能得到确切的MIC值的患者，则根据感染相关的可能病原菌对美罗培南MIC折点进行经验性判断。给药方案的优化：经过上述计算，如果f%T>MIC未达到或远远超出靶值，可在计算模型中保持之前k、V值不变，改变输入区域中的给药剂量、给药间隔，来实现f%T>MIC达标水平，从而调整最佳用药方案[5]。

3、讨论

美罗培南测定方法已有较多文献报道，其多用磷酸盐作流动相，但考虑使用磷酸盐时方法复杂，且会缩短色谱柱的使用时间，而用三乙胺配流动相既简单方便，又对色谱柱的影响较小，因此本文选择用三乙胺的水溶液作为流动相，《中国药典》也是用此方法，本文经过多次试验优化测定方法，以含三乙胺的水溶液(用磷酸调节pH为±5.0)-乙腈(92∶8)为流动相，取得较好的效果。稳定性：美罗培南的血样在室温条件下，浓度会随时间推移逐渐降解，但在0～8℃条件下，短时间内是相对稳定的，能够满足日常测定的需要。提取方法：对于血样的预处理，本文使用了乙腈蛋白沉淀法和二氯甲烷反萃取法，发现单用乙腈沉淀蛋白，提取回收率不是特别理想，因此本文采用二氯甲烷进行反萃取，使得回收率明显提高，且进样后峰形也很好。

本实验参考文献中美罗培南的血药浓度监测方法，对已有的高效液相色谱法进行了优化，使得该方法可用于我们现有仪器条件中，该方法简单易行，准确度高，可用于临床，且本法应用了碳青霉烯类药物的f%T>MIC计算模型，实现了患者应用该类药物的药效指标f%T>MIC评价，为患者的给药方案提供了评价依据。

利益冲突所有作者声明无利益冲突

参考文献:

[1]中华医学会血液学分会,中国医师协会血液科医师分会.中国中性粒细胞缺乏伴发热患者抗菌药物临床应用指南(2016年版)[J].中华血液学杂志,2016,37(5):353-359.

[2]中华医学会外科学分会外科感染与重症医学学组,中国医师协会外科医师分会肠瘘外科医师专业委员会.中国腹腔感染诊治指南(2019版)[J].中国实用外科杂志,2020,40(1):1-16.

[3]杨阳,李昕,徐兵,等.反相高效液相色谱法测定美罗培南的血药浓度及其临床应用[J].中南药学,2014,12(8):761-764.

[4]余兴华,成伙清,李滔.高效液相色谱法测定人血清美罗培南浓度[J].福建医药杂志,2008,30(4):78-79,113.

[5]陈文倩,杭永付,张丹,等.f%T>MIC计算模型的建立及重症患者碳青霉烯类抗菌药物个体化用药方案的优化[J].中国药学杂志,2018,53(15):1313-1317..

文章来源:安涛,张宏,刘静.高效液相色谱法测定美罗培南血药浓度在个体化用药中的应用[J].临床合理用药,2024,17(22):145-147.