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诊断超声脉冲重复频率对肿瘤化疗局部释药的影响

2021-03-13 269 上传者：管理员

摘要：目的观察相同占空比时,不同脉冲重复频率对阿霉素在肿瘤组织内药物浓度的影响,从而探讨其与超声空化靶向释药的相关性,以期优化超声空化靶向释药的调节参数。方法健康雌性裸鼠40只,建模成功后随机分为4组。阿霉素推注完成后匀速推注稀释的超声造影剂,同时按预定参数进行超声治疗,对照组予以假照。治疗后肿瘤组织取材以高效液相色谱法测定阿霉素药物浓度。结果多组间及两两组间比较阿霉素药物质量浓度差异无统计学意义。结论PRF为10～50Hz时肿瘤组织局部药物浓度差异较小,此区间PRF的调整对超声空化靶向释药影响不显著。

关键词：
肿瘤化疗局部释药
脉冲重复频率
药物浓度
诊断超声
超声空化
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近年来,超声空化作用下提高溶栓率[1]、促进软组织再生[2]、开放血脑屏障[3]、促进药物释放辅助肿瘤治疗[4]等超声空化治疗新技术已经越来越多地在医学研究中得以应用。然而,超声空化的发生本身就是随机和不可控的。如何更为精准地控制其生物学效应,是这些新技术临床转化过程中迫切需要解决的关键问题。

本课题组前期研究已经发现,在FDA规定的诊断超声能量范围内,当机械指数MI=0.3时,超声联合微泡能够增强肿瘤局部血流灌注、提高肿瘤组织局部化疗药物浓度[5,6]。那么如何才能提高局部释药浓度的可控性,使超声空化效应的发生更为精准,是作者需要深入研究的问题。既往研究发现脉冲重复频率(pulserepetitionfrequency,PRF)与超声空化发生的密度高度相关,是影响超声空化状态及其效应的重要参数之一。因此,本研究以阿霉素(doxorubicin,Dox)在肿瘤组织内局部药物浓度为指标,观察不同PRF对局部释药浓度的影响,探讨其与超声空化靶向释药的相关性,以期优化超声空化靶向释药的调节参数。

资料与方法

1.实验动物

40只健康雌性裸鼠,4周龄,由我院实验动物中心提供。

2.实验仪器与试剂

(1)仪器

使用飞依诺VINNO70彩色多普勒超声诊断仪;配备VFlash软件,为微泡调控软件,以实现对声波频率、PRF、脉冲宽度及脉冲时间等参数进行人为设定。

(2)试剂

脂氟显,由我院超声科以全氟丙烷为核心气体自主研制,微泡浓度为(4～9)×109/mL,平均粒径2μm。

3.实验方法

(1)裸鼠T47D皮下异位移植瘤模型建立于裸鼠后肢内侧皮下接种0.1mLT47D肿瘤细胞,浓度为(2～7)×106/mL,接种后2周,待皮下移植瘤长至1.0cm左右时进行实验。

(2)实验分组按照随机数表法将40只成功建模的裸鼠分为A组(PRF=10Hz)、B组(PRF=30Hz)、C组(PRF=50Hz)及D组(予以超声假照)。各组PRF选择依据为诊断超声输出能量范围及保持各组超声治疗占空比相同。各组探头频率均为5MHz、机械指数0.3。

(3)实验处理①用1%戊巴比妥钠对荷瘤裸鼠进行腹腔麻醉,将裸鼠仰卧、固定、建立尾静脉通道。使用VINNO70超声诊断仪X4-12L高频线阵探头对肿瘤进行常规扫查,记录肿瘤大小及血供情况等。

②Dox按照10mg/kg的剂量经尾静脉缓慢推注,推注完成后10min再行超声治疗。抽取0.1mL脂氟显以0.3mL生理盐水稀释,经尾静脉匀速推注,尾随0.1mL生理盐水冲管,总推注时间约9min。与此同时,使用X4-12L高频线阵探头VFlash模式,按照分组情况调节相应参数对荷瘤裸鼠进行超声治疗。辐照时探头轻置于肿瘤表面,避免压迫肿瘤。假照组Dox推注完成后10min,进行超声假照10min,并匀速推注0.4mL生理盐水。各组超声治疗后以0.9%的生理盐水灌注后取材行Dox药物质量浓度测定。

4.统计学方法

应用SPSS18.0软件进行统计分析。定量资料计算其标准差、均数、中位数、最大值、最小值等,以(x¯±s)表示。Dox药物质量浓度数据采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。

结果

1.裸鼠T47D模型

40只雌性裸鼠在接种后约10～14d后超声扫查见肿瘤大小均在1cm左右,最大径平均值为(1.13±0.03)cm,且肿瘤数目均为1个,内部未见明确肿瘤坏死,见图1,所有裸鼠乳腺癌模型成功建模并顺利完成全部实验内容。

图1裸鼠移植瘤超声图

2.肿瘤组织局部阿霉素药物浓度

A、B、C、D4组肿瘤组织局部Dox药物质量浓度分别为(0.162±0.029)μg/g、(0.170±0.058)μg/g、(0.186±0.045)μg/g、(0.187±0.060)μg/g,见图2。多组间Dox药物质量浓度的比较采用单因素方差分析,两两间比较采用LSD方法。结果显示各组间及两两组间比较差异无统计学意义。

图2各组肿瘤组织内Dox药物质量浓度

讨论

超声介导基因、药物靶向释放等技术的研究是目前超声治疗领域探讨的热点。由于影响超声空化发生的因素较多,因此这些以超声空化效应为基础的新型超声治疗技术具有一定的随机性和不可控性。这给超声空化效应的深入研究带来了挑战。超声空化分为瞬态空化和稳态空化两种状态。药物的靶向释放侧重于利用瞬态空化,瞬态空化所释放的能量能够瞬间穿透细胞膜[7],促进细胞摄取局部不通透的大分子物质,以促进局部的药物释放。有研究发现随着PRF的增加,超声瞬态空化增加,而稳态空化减少。这使得空化诱导的生物效应都与PRF有着密切的关系。但多数研究的超声能量均超过诊断超声要求的范围,本研究尝试在VINNO70超声诊断仪允许的PRF范围内,以MI=0.3、频率=5MHz为常量,观察PRF为10～50Hz时Dox在肿瘤组织局部的释药浓度。

本研究各组间肿瘤组织局部的药物浓度差异无统计学意义。这样的结果提示在10～50Hz区间,PRF的调整对超声空化靶向释药影响并不显著。SHIN等[8]作者也有类似的研究结果,其对20只成年大鼠脑部以不同PRF(1、2、5Hz)的超声波辐照,发现PRF对血脑屏障的开放与否影响不显著。CHENG等[9]作者也在研究中发现,对于短脉冲时间(50μs),PRF在1200Hz范围内,空化产生的超谐波强度与PRF没有显著相关性。而YANG等在以不同数量级PRF(1、10、100、1000Hz)辐照血栓时发现当PRF=1、10、100Hz时,溶栓率差异无统计学意义;当PRF=1000Hz时,溶栓率显著低于前3组(P<0.05)。KARSHAFIAN等[10]作者在对10～3000Hz范围内PRF的研究中发现,当超声峰值负压=570kPa、中心频率=500kHz、PRF=3000Hz、辐照时间=12s时,超声激励微泡空化所致的细胞通透性最高,且细胞的存活率也达到最高水平。综上分析认为本研究结果组间无统计学差异,可能是由于PRF设置能量级范围较低,导致超声激励微泡空化,特别是瞬态空化,所产生的生物学效应差异不显著。

PRF是诱导瞬态空化的重要参数,存在一定的阈值。在PRF阈值以下瞬态空化与PRF无关,在PRF阈值以上随着PRF的增加瞬态空化的发生率增加,PRF阈值≈ν/3Hz,其中ν为流体中微泡的速度,单位为mm/s。对于肿瘤组织的靶向释药,本实验各组PRF取值过低,在阈值以下,导致各组间的瞬态空化效应无明显差异。然而PRF阈值也是存在一定区间范围的,不断提高PRF的能量级并不是获得理想瞬态空化效应的有效途径。YANG等[11]学者对于高能量级PRF组(1000Hz)的溶栓率显著低于低能量级PRF组(1、10、100Hz)的研究结果就提示过高的PRF不会产生更加剧烈的瞬态空化,反而可能会导致有效空化效应的降低。因此,在对PRF进行设定时一定要考虑到具体研究内容所需的PRF阈值范围。过高或过低的PRF都不能很好地调控靶区空化效应。值得注意的是PRF阈值并非固定区间,不同研究内容和实验设计时,PRF阈值也不相同。流体中微泡的速度是影响PRF阈值的重要变量,KARSHAFIAN作者在PRF=3000Hz时获得差异显著的最佳实验效果,YANG等作者在PRF=1000Hz时溶栓率反而降低,就是由于血栓中微泡流速显著低于活体组织中微泡流速,进而产生了截然不同的空化效应。

本研究的局限性,由于实验时所用VINNO70超声诊疗一体机的PRF调节范围有限,且实验设计时没有深刻认识到PRF阈值的重要影响,因此未对更高能量级及更大范围的PRF进行实验研究。而本研究的结果作者不仅认识到了PRF的阈值对于空化效应的重要性,同时也意识到肿瘤微循环中微泡流速的重要性。这不仅为后期实验仪器参数优化调整提供了数据参考,也为进一步深入研究超声空化肿瘤治疗打开了新的思路。

结论

PRF存在一定的阈值范围,当PRF为10～50Hz时,肿瘤微循环中的药物浓度无明显差异;此范围的PRF对超声空化靶向肿瘤组织的释药无显著影响。

参考文献：

[1]王珊,朱贤胜.持续灌注微泡并低强度超声介导体外血栓溶栓的实验研究[J].中国超声医学杂志,2020,36(2):185-187.

[5]冯爽,乔伟,益磋,等.不同机械指数诊断超声联合微泡对裸鼠胰腺癌移植瘤化疗的影响[J].中国介入影像与治疗学,2019,16(2):107-111.

[6]王亚辉,益磋,冯爽,等.诊断超声产生的血流增强效应及肿瘤释药研究[J/OL].中华医学超声杂志:电子版,2018,15(4):303-308.

[7]洪丽杰,蒋天安,叶萌,等.低频超声微泡抑制裸鼠卵巢癌皮下移植瘤生长的初步研究[J].中国超声医学杂志,2019,35(3):278-281.

陈晓琴,刘政,贡雪灏,黄蕾丹,朱琼,李佩倞.诊断超声脉冲重复频率对肿瘤化疗局部释药的影响[J].中国超声医学杂志,2021,37(03):348-350.

基金:国家重点研发计划数字诊疗装备研发重点专项(No.2017YFC0107300);深圳市科技计划项目(No.JCYJ20170413161913429)