在我国，子宫内膜癌(endometrial carcinoma, EC)是仅次于宫颈癌的第二大女性生殖系统恶性肿瘤。2022年统计学数据显示，我国子宫恶性肿瘤发病人数为7.77万人，死亡人数为1.35万人[1]。近年来，我国EC发病率呈上升趋势且发病年龄逐渐年轻化[2]。EC具有高度异质性，2013年癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)根据基因组学特征将EC分为4个预后不同的分子亚型[3],但相同分子亚型预后仍存在差异。此外，EC的靶向治疗和免疫治疗的进展和临床应用相对滞后，亟待发现更多的分子标志物。

骨桥蛋白(osteopontin, OPN)由分泌型磷蛋白1(secreted phosphoprotein 1,SPP1)基因编码，也称为早期T淋巴细胞激活蛋白1(early T-lymphocyte activation 1,ETA1),是小整合素结合配体N-连接糖蛋白(small integrin binding ligand N-linked glycoprotein, SIBLING)家族成员。SPP1是一种在多种组织中表达的酸性糖基化磷蛋白，参与许多生理和病理过程，包括血管形成、细胞再生、钙化、炎症和免疫调节疾病、神经系统疾病以及癌症。SPP1在多种类型肿瘤中高表达，组织和外周血游离SPP1可能是肿瘤预后因子[4],但SPP1与EC的价值及预后相关性研究证据不足。

程序性死亡蛋白配体1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)是广泛认可的免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors, ICIs)标志物。然而PD-L1高表达对ICIs疗效预测的敏感性和特异性有限，部分PD-L1低表达或阴性的患者对ICIs仍敏感，也有一些临床研究表明部分PD-L1表达阳性的患者对ICIs反应低。POLE突变和高度微卫星不稳定性(microsatellite instability-high, MSI-H)型EC是ICIs潜在受益人群[5]。PD-L1在EC免疫治疗中的作用尚未阐明，PD-L1的表达与EC的预后是否相关尚存争议。寻找新的EC免疫相关标志物，对促进免疫治疗在EC中的应用具有重要意义。

1、材料与方法

1.1 研究对象

收集2016年03月至2018年12月于山西省人民医院(我院)确诊并进行手术治疗的84例EC患者的手术组织标本，患者年龄33～78岁，平均(55.43±9.21)岁。收集病理类型、绝经状态、国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO)分期、组织学分级、肌层浸润深度和淋巴结转移等临床信息及随访记录。采用随机数表法选取同期诊断性刮宫获取的61例正常子宫内膜标本，患者年龄36～72岁，平均(53.74±7.3)岁，与EC患者年龄比较差异无统计学意义(t=1.478,P=0.349)。本研究已经我院伦理委员会批准。

1.2 纳入及排除标准

纳入标准包括：①接受全子宫切除术；②经术后组织病理学检查确诊为EC患者；③均为初诊初治患者；④积极配合治疗且随访资料完整。排除标准包括：①心肝肾等脏器功能严重异常；②存在凝血障碍、自身免疫性疾病、急慢性感染等疾病；③合并其他类型肿瘤；④已接受化疗、放疗和免疫治疗等抗肿瘤治疗；⑤临床及随访资料不全或失访者。

1.3 免疫组织化学染色

鼠抗人SPP1单克隆抗 体(克隆号OTI2F2)和鼠抗人PD-L1单克隆抗体(克隆号OTI9E12)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，免疫组织化学SP法试剂盒(货号KIT-0105M)、PBS缓冲液和DAB试剂盒均购自福州迈新生物技术公司。采用常规石蜡切片法，4～6 μm切片，免疫组织化学染色严格参照说明书进行。SPP1和PD-L1一抗稀释比例分别为1∶100和1∶150。

SPP1阳性染色主要定位于细胞膜和细胞质，细胞核不着色，在高倍镜下每张切片随机观察5个视野，每个视野计数100个肿瘤细胞中的阳性细胞数。染色强度评分：基本不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞百分比评分：<10%为0分， 10%～25%为1分， >25%～50%为2分，>50%为3分。染色强度与阳性细胞百分比的乘积≥3分为阳性(+)。PD-L1主要表达于细胞膜或细胞质，在高倍镜下每张切片随机观察5个视野，每个视野计数100个肿瘤细胞中的阳性细胞数。所有 细胞中阳性细胞的百分数<1%判为阴性(-),阳性细胞的百分数≥1%判为阳性(+)。免疫组织化学结果均由2名病理医生独立进行评分，对于存在争议的结果由第3位病理专家参与讨论达成一致结论。

1.4 TCGA数据库分析

使用UALCAN分析工具分析TCGA数据库EC样本中SPP1和PD-L1表达水平及与预后的关系，使用GEPIA2在线分析工具分析SPP1和PD-L1表达相关性。

1.5 统计学方法

使用SPSS 26软件进行统计学分析。符合正态分布的定量资料采用均数±标准差

表示，组间比较采用两独立样本均数的t检验。定性资料采用例数(百分比)表示，组间比较采用卡方检验。以总生存期(overall survival, OS)为临床结局进行生存分析并绘制Kaplan-Meier生存曲线，生存曲线比较采用log-rank检验法。所有检验均以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 SPP1和PD-L1在EC组织和正常子宫内膜组织中的表达

免疫组织化学染色结果显示，SPP1在EC组织中表达于细胞质、细胞膜和细胞外基质(extracellular matrix, ECM), PD-L1表达于细胞膜，见图1。EC组织的SPP1阳性表达率显著 高于正常子宫内 膜组织(71.43% vs 36.07%,χ2=17.985,P=0.001),PD-L1阳性表达率显著低于正常子宫内膜组织(25.00% vs 42.62%,χ2=5.010,P=0.025)。

图1 EC组织中SPP1和PD-L1蛋白的表达(免疫组织化学染色×20)

2.2 EC组织中SPP1和PD-L1表达与患者临床特征的 关系

不同年龄、绝经状态、组织学类型、FIGO分期、肌层浸润深度、淋巴结转移和复发情况的患者SPP1阳性表达率比较，差异无统计学意义(均P>0.05);不同组织学分级患者的SPP1阳性表达率比较，差异有统计学意义 (P<0.05),见表1。不同年龄、绝经状态、组织学类型、FIGO分期、组织学分级、肌层浸润深度和复发情况的患者PD-L1阳性表达率比较，差异无统计学意义(均P>0.05);淋巴结阳性患者的PD-L1表达阳性率高于淋 巴结阴性患者，差异 有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 SPP1和PD-L1表达水平与EC患者临床特征的关系n(%)

2.3 EC组织中SPP1与PD-L1蛋白表达相关性

EC组织中SPP1与PD-L1表 达呈正相关(列联系数r=0.237,P=0.026),见表2。

2.4 SPP1和PD-L1蛋白表达与预后的关系

生存分析结果显示，SPP1和PD-L1表达阳性组与阴性组的OS比较，差异均无统计学意义(均P>0.05),见图2(SPP1:χ2=0.387,P=0.534;PD-L1:χ2=0.948,P=0.330)。

表2 SPP1与PD-L1表达水平的相关性分析

图2不同SPP1(A)和PD-L1(B)蛋白表达患者总生存曲线

2.5 TCGA数据库中EC组织SPP1和CD274(PD-L1)基因表达及预后分析

TCGA数据库EC组织(n=546)SPP1 mRNA表达水平显著高于正常子宫内膜组织(P<0.01,见图3A),PD-L1 mRNA表达水平与正常子宫内膜组织比较，差异无统计学意义(P=0.057,见图3B)。GEPIA2分析显示，TCGA数据库EC组织SPP1 mRNA和PD-L1 mRNA表达水平呈正相关(相关性系数r=0.350,P<0.05,见图3C)。生存分析结果显示，不同SPP1和PD-L1表达患者OS无差异 (均P>0.05,见图3D-E)。

图3 TCGA数据库中EC组织SPP1和CD274(PD-L1)基因表达及预后分析

3、讨论

SPP1是一种分泌型趋化因子样磷酸化糖蛋白，参与肿瘤细胞增殖、转移和免疫逃逸等过程，癌组织和游离SPP1可能是肿瘤预后因子[4]。SPP1在EC中的作用尚存争议，一项研究发现SPP1在EC组织中高表达，血浆SPP1水平也显著高于健康者，SPP1阳性是无病生存期(disease free survival, DFS)较差的独立预后因子[6]。ZHU等[7]基于GEO数据库筛选出EC组织与正常子宫内膜组织40个差异表达基因，通过蛋白互作网络(protein-protein interaction networks, PPI)分析确定了6个核心基因：COL1A1、IGF1、COL5A1、CXCL12、PTEN和SPP1,这6个核心基因的表达水平与OS和无进展生存期(progression free survival, PFS)显著相关。另一项研究则发现EC中SPP1阳性表达率低于正常EC组织，SPP1与EC的组织学类型、FIGO分级、肿瘤大小、肌层浸润、淋巴血管浸润和淋巴结转移均无关，SPP1强染色与更好的OS相关，与本研究及其他报道均不一致[8],可能与这些研究的纳入样本量均较少有关。本研究基于84例EC样本和TCGA数据库分析发现，SPP1 mRNA和蛋白在EC中均高表达，生存分析提示SPP1高表达者预后可能较差，但差异无统计学意义；此外，SPP1在内膜样癌和浆液性癌中均有较高的阳性表达率，这与先前的报道一致[9-10];本研究显示SPP1表达与组织学分级有关，G3级EC具有更高的阳性表达率。以上结果表明，SPP1可能在EC发生发展过程中具有调控作用。在EC细胞系(HEC-1A和Ishikawa细胞)中敲低OPN(SPP1)基因表达可改变EC细胞增殖能力，OPN细胞膜受体表达、细胞周期调节相关基因表达、细胞侵袭和集落形成分析均发生相应改变，这些改变在EC细胞中表达重组OPN的情况下被逆转[11-12]。重组OPN可以促进人EC细 胞(HEC-1A)增殖、迁移和侵袭，OPN上调HEC-1A细胞中的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关因子(N-cadherin和Vimentin)以及基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)蛋白表达，rhOPN通过蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)和细胞外信号调控的激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)信号通路促进HEC-1A细胞迁移、侵袭和EMT[13]。有研究发现SPP1(OPN)基因的2种不同剪接变异体OPNb和OPNc可能参与了EMT过程，与正常子宫内膜相比，OPNb和OPNc在子宫内膜异位症和子宫腺肌症中过表达，OPNb和OPNc剪接变体在子宫内膜异位细胞中过表达，并通过结合OPN配体受体CD44和αvβ3诱发形态学变化、肌动蛋白重塑、细胞增殖、细胞迁移和EMT,随后激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)和核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路[14]。LIU等[15]使用2D液相色谱质谱/质谱联用(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)定量蛋白质组学鉴定EC组织和配对癌旁组织中的差异表达蛋白，发现差异蛋白显著富集到PI3K/AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)通路相关分子(包括PI3K、mTOR、ERK、SPP1和ANGPT2),可能参与EC发生发展，EC中SPP1高表达可能通过激活PI3K/AKT/mTOR通路促进EC进展。

PD-L1是一种重要的免疫调节因子，在癌细胞的免疫逃逸机制中起关键作用可能影响预后。2022年一项Meta分析显示PD-L1蛋白在EC患者肿瘤细胞中的阳性表达率为34.26%,在EC患者肿瘤浸润免疫细胞中的阳性表达率为51.39%[16]。对于术后高危组EC患者，PD-L1阳性与高危EC人群预后良好有关[17]。另有研究发现， EC肿瘤细胞PD-L1表达与EC组织学类型显著相关，Ⅱ型EC(非内膜样癌)PD-L1阳性表达率更高，此外，PD-L1是淋巴节转移的独立预后因子[18],这与本研究结果一致。一项回顾性研究发现EC肿瘤组织PD-L1表达与OS不相关，与高级别(G3)子宫内膜样腺癌及MLH1/PMS2蛋白丢失相关[19],另一项Meta分析也得出了相似结论[20]。

本研究发现EC组织中SPP1与PD-L1在转录和翻译水平均呈正相关，提示SPP1可能与EC免疫微环境有关。大量研究表明SPP1基因参与肿瘤-免疫系统调节，一项泛肿瘤生物信息学分析发现SPP1 mRNA表达水平与树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞呈正相关，SPP1可能参与髓系细胞分化和白细胞诱导肿瘤免疫逃逸[21]。FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞有助于ECM重塑并协调形成促纤维增生微环境，防止淋巴细胞浸润肿瘤核心，进一步降低PD-L1治疗的疗效，FAP+成纤维细胞受TWIST1调节，TWIST1的表达由缺氧诱导；chemerin可进入血管并与THBS1+巨噬细胞结合，后者可能分化为SPP1+巨噬细胞；此外，SPP1+巨噬细胞可能通过TGFB1调节FAP+成纤维细胞，从而促进MMP和胶原蛋白的分泌，它们共同促进ECM的重塑[22]。对胃癌数据集(GSE26942、GSE13911和GSE118916)的分析发现COL1A1、THBS2和SPP1影响胃癌免疫微环境，且COL1A1、THBS2、SPP1和PD-L1表达之间存在显著相关性，这些基因富集到ECM-受体相互作用和黏着斑信号通路，表明COL1A1、THBS2和SPP1可能有助于预测胃癌患者的免疫治疗疗效[23]。SPP1可能协同PD-L1参与肺腺癌肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage, TAM)极化过程，进而参与介导肺癌逃逸[24]。此外，SPP1可能作为免疫检查点来抑制T细胞活化并导致肿瘤免疫耐受性，IRF8与SPP1启动子结合抑制结肠上皮细胞中SPP1的表达，结肠癌中观察到IRF8表达下调和SPP1表达上调，而结肠癌中SPP1表达上调与患者生存率低相关[25]。低氧环境是诱导肿瘤免疫抑制的重要因素，一项研究发现“冷免疫型”结直肠癌差异基因(包括SPP1)主要与低氧信号有关，SPP1 mRNA在“冷免疫型”亚组表达显著上调[26]。SPP1参与介导肿瘤免疫逃逸可能与低氧诱导、T细胞免疫检查点抑制、巨噬细胞极化和ECM重塑等过程有关。

鉴于过往相关研究的结论不一致可能与样本量小有关，本研究回顾性分析84例EC临床样本发现SPP1虽在EC中高表达，且与PD-L1表达呈正相关，但两者与患者预后均无关，通过TCGA数据库基于RNA水平分析进一步得出相同结论，表明SPP1和PD-L1均不是EC的独立预后因子，可能归因于不同组织学类型和不同分期分级的EC的生物学特征差异较大，对预后影响较大，本研究未针对这些因素进行亚组分析。此外，本研究仍存在一些局限性，如仅基于临床样本进行分析，未进行体内和体外实验验证，对照样本选自接受刮宫的未癌变患者，对照组未能排除存在其他类型疾病的影响。

综上，本研究表明SPP1在EC中高表达且 与PD-L1正相关，SPP1和PD-L1均不是EC独立预后因子， SPP1在EC免疫微环境中的作用及与PD-L1的作用机制有待进一步阐明。

参考文献:

[1]郑荣寿,陈茹,韩冰峰,等.2022年中国恶性肿瘤流行情况分析[J].中华肿瘤杂志,2024,46(3):221-231.

文章来源:胡帅,武霞,晋雨楠,等.SPP1和PD-L1在子宫内膜癌组织中的表达及其预后价值[J].现代肿瘤医学,2024,32(21):4121-4126.