子宫内膜癌(Endometrialcancer,EC)是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤｡2022年美国癌症统计数据显示,EC每年新发病例数约6.59万例,位居女性恶性肿瘤发病率第四名;年死亡病例数约1.26万例,位居女性恶性肿瘤死亡率第六位,并呈逐年上升趋势[1]｡近年来,研究发现,表观遗传学在EC的发生和发展中扮演着重要角色[2-3]｡其中,MutL同源物1(MutLhomolog1,MLH1)基因启动子区域的甲基化作为EC中一种常见的表观遗传改变受到广泛关注[4]｡MLH1基因编码的MLH1蛋白是细胞内错配修复(Mismatchrepair,MMR)系统的关键成分,在DNA复制和细胞分裂过程中发挥关键作用[5]｡然而,当MLH1基因启动子区域发生甲基化时,会导致该基因表达受到抑制,影响MMR系统的正常功能,增加基因突变和癌症发生的风险[6]｡因此,现对MLH1基因启动子甲基化的分子机制､检测方法及其在EC临床诊断､治疗策略及预后评估中的应用进行综述,以期为EC的早期诊断和治疗提供新的思路｡

1、DNA甲基化及MLH1基因启动子甲基化分子机制

DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,能在不改变DNA序列的前提下改变遗传表现[7]｡DNA甲基化是在DNA甲基转移酶(DNMT)的催化下,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体,将甲基基团转移到CpG位点的胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶(5mC)的过程[8]｡DNA甲基化在调控基因表达､维持基因组稳定性及细胞分化等方面均发挥重要作用[9-10]｡

MLH1基因是位于人类第3号染色体长臂3p21.1-21.3区域的抑癌基因｡MLH1基因启动子甲基化是结直肠癌(CRC)和EC常见的表观遗传改变[4]｡MLH1基因的启动子区域富含CpG岛,当这些位点发生异常甲基化时,会吸引特定的DNA结合蛋白,招募染色质重塑复合体,进而改变组蛋白的乙酰化状态,使染色质结构紧密,从而阻碍转录因子和RNA聚合酶Ⅱ结合,抑制MLH1mRNA合成,最终引起MLH1基因沉默,错配修复系统功能受损[11]｡当DNA复制过程中错误配对的核苷酸不能被有效识别和修复时,微卫星序列长度或碱基组成发生改变,出现微卫星不稳定性(MSI),增加基因组的不稳定性和突变风险[12-13]｡此外,DNA修复能力下降后,细胞在面对DNA损伤时无法有效启动损伤应答机制,可导致细胞周期紊乱和异常增殖,促进肿瘤的发生和发展[15]｡CORNEL等[14]研究发现,MLH1基因启动子甲基化程度从正常子宫内膜(27.3%)到非典型子宫内膜增生(36.4%)再到EC(38.0%)逐渐升高,揭示了MLH1基因启动子甲基化在EC发展中的重要作用｡

MLH1基因启动子甲基化还能影响肿瘤微环境[13]｡错配修复缺陷(MMRd)肿瘤通常具有较高的肿瘤突变负荷(TMB),吸引更多免疫细胞浸润,特别是CD8+细胞毒性T细胞[16]｡在肿瘤微环境中,程序性死亡受体1(PD-1)与程序性死亡配体1(PD-L1)的相互作用可抑制T淋巴细胞功能,使肿瘤细胞实现“免疫逃逸”[17]｡研究显示,相较于MLH1基因胚系突变EC患者,MLH1高甲基化EC患者的免疫微环境特征中PD-L1阳性率､免疫检查点基因表达､免疫细胞浸润､T细胞炎症评分和干扰素-γ(IFN-γ)评分均降低,Janus激酶1基因(JAK1)､成纤维细胞生长因子受体2基因(FGFR2)､细胞周期蛋白D1基因(CCND1)和同源性磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)等突变率增加[18]｡这些免疫微环境差异可能影响相关EC患者对免疫治疗的反应｡

2、MLH1基因启动子甲基化检测方法

2.1传统检测方法

2.1.1亚硫酸氢盐测序(BSP):利用亚硫酸氢盐处理基因组DNA,使胞嘧啶残基(C)转化为尿嘧啶(U),而5mC保持不变,PCR扩增后,尿嘧啶被识别为胸腺嘧啶(T),甲基化的胞嘧啶仍被检测为胞嘧啶,通过测序比对处理后的DNA序列与原始序列,精确检测单个CpG位点的甲基化状态[19]｡

2.1.2甲基化特异性PCR(MSP):利用两对特异性PCR引物,结合TaqMan探针,分别扩增经亚硫酸氢盐转化后的甲基化与非甲基化DNA,检测特定CpG位点的甲基化状态[20]｡该方法特异性强,灵敏度高,适用于大量样本的DNA片段检测[20]｡

2.1.3焦磷酸测序:通过监测DNA聚合酶催化的脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)掺入反应,定量分析经亚硫酸氢盐转化后的DNA甲基化水平,能精确定量单个或连续CpG位点的甲基化频率,适合于已知短序列甲基化位点和单核苷酸多态性的定量检测[21]｡

2.1.4甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-HRM):通过分析DNA双链随温度升高解离的特性,比较熔解曲线的差异,定量分析MLH1基因甲基化水平｡该方法对仪器要求高,且无法明确每个CpG位点的甲基化状态[22]｡

2.2新型检测方法

2.2.1单细胞表观基因组学技术:包括单细胞全基因组亚硫酸氢盐测序(scWGBS)和单细胞简化代表性亚硫酸氢盐测序(scRRBS)｡对单个细胞的基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理,通过下一代测序(NGS)技术测序,精确检测单个CpG位点的甲基化状态,提供单细胞水平甲基化图谱,揭示细胞间的表观遗传异质性[23-24]｡

2.2.2人工智能算法:例如MethyBERT模型,能够根据甲基化模式和基因组序列识别肿瘤来源的序列读数,估计大量样本中的肿瘤细胞分数｡在液体活检样本中,无论DNA甲基化模式的复杂程度､读取长度和读取覆盖率如何,MethyBERT模型均能准确进行读数分类和肿瘤纯度估计[25]｡

MLH1基因启动子甲基化检测技术丰富多样,临床应用可根据需求选择,MLH1基因启动子甲基化检测方法总结见表1｡未来研究可探索更多新型检测技术在ECMLH1基因启动子甲基化分析中的应用潜力,有助于提高EC的诊断和治疗水平｡

表1MLH1基因启动子甲基化检测方法

3、MLH1基因启动子甲基化在EC中应用的研究进展

3.1MLH1基因启动子甲基化在EC诊断中的应用在EC的分子分型中,MLH1基因启动子甲基化是MSI-H/MMRd型EC最常见的原因,约占70%~75%[26]｡指南推荐使用MMR蛋白免疫组织化学法(IHC)或MSI检测来评估MMR/MSI状态[27]｡研究表明,MMR蛋白的IHC检测与MSI状态的NGS检测结果间的一致性高达94.3%,不一致的情况主要出现在MLH1基因启动子高甲基化导致的MLH1和PMS2蛋白表达共缺失或MMR蛋白亚克隆缺失[28]｡因此,综合运用MLH1基因甲基化检测､MMR-IHC及MSI-PCR/MSI-NGS检测,可为EC患者提供精准的分子分型｡

林奇综合征(LS),又称遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)综合征,是一种以MMR基因(包括MLH1､MSH2､MSH6､PMS2)之一或上皮细胞黏附分子(EPCAM)基因胚系突变引起的常染色体显性遗传病,约占所有EC的2%~6%[29]｡目前,国内外指南普遍建议对EC患者进行LS的常规筛查｡由于MLH1基因启动子甲基化在EC-LS中极为罕见,通常被用于区分散发性和遗传性MMRd/MSI肿瘤[30-31]｡然而,有研究揭示了在少数病例中,即使存在致病性MLH1基因胚系突变,也可能观察到MLH1基因启动子高度甲基化现象[32-33]｡CARNEVALI等[34]对61例癌症患者进行MLH1基因启动子甲基化和MLH1/PMS2胚系变异调查,发现在携带MLH1胚系致病突变患者中分别有16.7%的CRC和40%的EC中发现了体系MLH1基因启动子的高甲基化｡这些研究表明,MLH1基因启动子甲基化存在并不能排除LS｡因此在临床实践中,当结合患者的家族史和个人史后高度怀疑LS时,无论MMR状态如何,均应进行LS相关基因胚系突变检测以确诊｡

结构性MLH1表观突变的特征表现为正常组织中MLH1启动子的单等位基因甲基化,同时伴随该等位基因特异性沉默,是一种潜在的遗传性表观遗传学变化,也可导致与LS相关癌症易感性[35-36]｡研究发现,约1/3的结构性MLH1基因表观突变的女性携带者在60岁之前发生EC[37]｡这种表观突变可分为与基因序列变化相关联的常染色体显性遗传模式,或没有明显序列变化的非孟德尔遗传模式,但很少有家族性病例被描述[38-39]｡在首次诊断时,将结构性MLH1表观突变的病例与散发性体细胞起源的MLH1甲基化肿瘤病例区分,有利于患者接受适当的遗传咨询和监测｡

3.2MLH1基因启动子甲基化在EC治疗中的应用EC的治疗主要以手术为主,辅以放疗､化疗､免疫治疗及靶向治疗等多种手段｡手术的范围和程度需根据患者的临床分期和肿瘤特征进行个体化调整,术后则依据病理结果及是否存在高危因素选择辅助治疗[40]｡2024年EC分子分型临床专家共识推荐,MMRd型EC中高危患者如国际妇产科联盟(FIGO)2023分期中的ⅠB-ⅣA期推荐术后辅助放疗,包括阴道近距离放疗和盆腔外照射放疗;对于高危患者如FIGO2023分期中的ⅡC-ⅣA期推荐同步或序贯放化疗[41]｡REIJNEN等对128例ⅠB-Ⅱ期EC患者进行回顾性分析,在多变量分析中发现辅助放疗与MMRd型EC患者疾病特异性生存率提高相关[42]｡此外,SHERWANI等[43]对823例接受术后辅助放疗的FIGOⅠ-Ⅱ期的子宫内膜样腺癌患者进行回顾性队列研究,结果显示,MLH1基因启动子甲基化患者的无复发生存期(RFS)相较于体细胞MMR基因缺陷型患者和MMR功能完整患者更差(分别为73.5%､86%和92%),但总生存期(OS)比较差异无统计学意义,且MLH1基因启动子甲基化患者局部区域复发占比更高,这可能表明MLH1基因启动子甲基化EC患者更需要加强局部区域治疗｡

MMRd型肿瘤通常具有较高的突变负荷,并伴有大量淋巴细胞浸润,因此对免疫治疗表现出较好的反应[44-45]｡2017年美国食品和药品监督管理局批准免疫检查点PD-1抑制剂应用于MMRd实体瘤患者｡一项Ⅲ期临床实验NRG-GY018结果显示,在MMRd队列的12个月分析中,化疗(卡铂+紫杉醇)联合帕博利珠单抗组患者的疾病进展或死亡风险较单独化疗组低70%(HR=0.30)[46]｡此外,一项Ⅱ期多队列临床试验KEYNOTE-158更新结果显示,帕博利珠单抗在治疗MSI-H/MMRd晚期EC中,客观缓解率(ORR)达50%,中位无进展生存期(PFS)为13.1个月[47]｡然而,TOBONI等[18]研究发现,MLH1基因启动子甲基化相关EC通常为免疫冷表型,表现为PD-L1阳性率低,免疫细胞浸润减少,T细胞炎症评分和IFN-γ评分降低,该人群接受PD-1抑制剂的ORR较LS-EC患者低(35%vs60%)｡CHOW等[48]在24例MMRd-EC患者中进行了PD-1抑制剂帕博利珠单抗的Ⅱ期临床试验,结果显示,突变型MMRd肿瘤患者的反应率高于MLH1基因启动子甲基化患者,且有更长的生存期｡表明MLH1基因启动子甲基化是影响疾病特异性生存的独立危险因素,免疫治疗单药或联合化疗对于MLH1基因启动子甲基化相关EC具有一定疗效,但可能无法获得与MMR基因突变患者相同的治疗效果,在免疫治疗选择上仍需特别考虑｡

MLH1基因启动子甲基化还可能成为潜在的治疗靶点｡DNMT抑制剂如5-氮杂胞苷､地西他滨等,已被广泛应用于表观遗传学调控[49]｡其通过降低DNA甲基化水平恢复MLH1基因表达,进而抑制肿瘤生长[50]｡研究证实,当DNMT抑制剂与组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂联合使用时,可协同增强MLH1基因的重新激活效果,展现出更强大的抗癌效果,并已在乳腺癌､甲状腺癌等多种恶性肿瘤的治疗中表现出积极成果[51-53]｡随着相关研究不断深入,这些新兴药物有望为EC患者拓展治疗途径,提供更多元化的治疗选择｡未来针对MMRd型EC的进一步精准分层,深入探索与之适配的治疗策略,能够为改善患者预后､提高治疗效果提供有力支持｡

3.3MLH1基因启动子甲基化在EC预后中的应用MLH1基因启动子甲基化状态与EC患者预后密切相关｡研究表明,MLH1基因启动子高甲基化的肿瘤表现出更差的预后特征,包括高级别､淋巴脉管间隙浸润(LVSI)､晚期和年龄较大的患者[43]｡有研究采用免疫组化和甲基化特异性多重连接探针扩增(MS-MLPA)技术分析了527例EC样本,结果显示,MLH1甲基化的EC患者中,低级别肿瘤比例较低(37.5%),Ⅲ/Ⅳ期肿瘤比例较高(37.2%),其OS和PFS均显著差于疑似LS患者[54]｡SHIKAMA等[55]研究提出,疑似LS患者和MLH1甲基化EC患者间的预后差异可能归因于疑似LS患者对辅助治疗的敏感性更高｡在一项单臂､开放标签的Ⅱ期研究中,评估了帕博利珠单抗治疗复发性dMMR/MSI-HEC患者的疗效,研究发现MLH1甲基化患者与疑似LS患者相比,ORR､PFS和OS均较差,表明MLH1基因的高甲基化可预测帕博利珠单抗在复发性EC患者治疗中的不良预后[56]｡此外,MLH1启动子甲基化还与肿瘤的复发和转移风险增加有关｡一项回顾性研究通过焦磷酸测序分析,调查了MLH1甲基化与子宫内膜样腺癌患者预后间的复杂联系,结果显示,无MLH1甲基化患者的复发率高于有甲基化患者,但生存率似乎不受甲基化的影响｡定量百分比显示,较高的MLH1甲基化与复发和死亡率有关[57]｡综上所述,MLH1启动子甲基化是一种与EC预后密切相关的生物学标志物,其状态可作为评估EC预后的独立标志｡通过对MLH1基因启动子甲基化的状态检测,临床医生能够更精准地把握患者的疾病进展和潜在风险,进而为制定个体化的治疗方案提供重要依据,进一步提高患者的生存率和生活质量｡

4、小结与展望

MHL1基因启动子高甲基化可导致MLH1基因沉默,进而影响细胞周期调控､DNA损伤修复及肿瘤免疫微环境等,在EC的发生和发展中发挥重要作用｡深入探讨MLH1基因启动子甲基化的生物学机制及检测技术,有助于为EC的分子诊断与治疗手段提供理论支持｡然而,目前MLH1基因甲基化的检测方法多样,不同平台和技术间的结果差异显著,故需要更多实验来验证并建立标准化检测方法,以提高检测的准确性和可重复性｡此外,MLH1基因甲基化状态在EC的治疗决策和预后评估中也至关重要｡与未发生MLH1甲基化的MMRd-EC比较,MLH1甲基化相关EC患者预后更差,对免疫治疗的反应较差｡值得注意的是,针对MLH1基因启动子甲基化的靶向治疗已在多种癌症类型中展现出良好疗效,特别是当DNMT抑制剂与HDAC抑制剂联合使用时,能显著增强抗癌效果,但在EC领域,这类组合疗法的安全性和有效性仍需更多研究证实｡未来随着研究进一步深入,针对MLH1基因启动子甲基化的精准治疗有望为EC患者开辟新的治疗途径｡

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文章来源:李晓盈,张鑫,张伟健,等.MLH1基因启动子甲基化在子宫内膜癌中的应用研究进展[J].陕西医学杂志,2025,54(05):711-715+720.