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miR-195-5p调控SIRT4对子宫内膜癌细胞的影响

2025-04-28 24 上传者：管理员

摘要：目的探究miR-195-5p调节SIRT4对子宫内膜癌HEC-1A细胞转移活性的影响，以期为子宫内膜癌的治疗寻找新靶点。方法通过实时荧光定量PCR实验分析子宫内膜上皮细胞与子宫内膜癌细胞中miR-195-5p与SIRT4的表达。将子宫内膜癌HEC-1A细胞分为miR NC实验组、miR-195-5p inhibitor实验组、pcDNA3.1 NC实验组以及pcDNA3.1 SIRT4实验组。分析miR-195-5p与SIRT4在不同细胞中的表达，观察mi R-195-5p与SIRT4对HEC-1A细胞增殖活性、侵袭能力及迁移能力的影响，分析HEC-1A细胞中miR-195-5p与SIRT4靶向关系。结果 HEC-1A细胞、Ishikawa细胞及MFE-296细胞的miR-195-5p表达高于ECS细胞；HEC-1A细胞、Ishikawa细胞及MFE-296细胞的SIRT4 mRNA表达低于ECS细胞，差异均有统计学意义（P<0.01）。培养24、36 h,mi R-195-5p inhibitor实验组的HEC-1A细胞的增殖能力低于miR NC实验组，pcDNA3.1 SIRT4实验组的HEC-1A细胞的增殖能力低于pcDNA3.1 NC实验组，差异均有统计学意义（P<0.05）。miR-195-5p inhibitor实验组的HEC-1A细胞的侵袭数、迁移率均低于miR NC实验组，pcDNA3.1 SIRT4实验组的HEC-1A细胞的侵袭数、迁移率均低于pcDNA3.1 NC实验组，差异均有统计学意义（P<0.05）。在SIRT4-WT实验组中转染miR-195-5p mimic后荧光素酶活性低于miR NC实验组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论在子宫内膜癌细胞中miR-195-5p高表达，而SIRT4低表达。miR-195-5p通过靶向调控SIRT4的表达进而影响子宫内膜癌HEC-1A细胞的增殖、迁移及侵袭。因此，miR-195-5p/SIRT4可能是治疗子宫内膜癌的新靶点。

关键词：
HEC-1A细胞
mi R-195-5p
SIRT4
子宫内膜癌
恶性肿瘤
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子宫内膜癌属于子宫内膜上皮的恶性肿瘤,尽管早期诊断､手术以及放化疗等手段可以有效改善患者病情,但部分子宫内膜癌患者经治疗后仍有癌细胞转移的情况发生[1-2]｡因此阐明子宫内膜癌发生发展的具体分子机制,探索子宫内膜癌治疗的有效靶点至关重要｡研究证明[3-4],沉默调节蛋白4(Sirtuin4,SIRT4)属于Sirtuins家族蛋白成员之一,与多种妇科肿瘤进展相关,然而SIRT4在子宫内膜癌进展过程中发挥的作用尚未明确｡研究表明,微小核糖核酸(microRNA,miRNA)在肿瘤进展和治疗中具有重要作用｡近期研究发现,miR-195-5p在子宫内膜癌中表达上调[5],并且根据GEO数据库分析显示,在子宫内膜癌患者外周血的差异表达的miRNA中,miR195-5p上调的最为明显｡这些结果提示,miR-195-5p可能在子宫内膜癌进展中发挥关键作用｡因此,深入探索miR-195-5p及SIRT4对子宫内膜癌进展的影响机制具有重要意义｡

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料人子宫内膜癌细胞株HEC-1A细胞､Ishikawa细胞､MFE-296细胞､人正常子宫内膜上皮细胞株ECS细胞株购自中国科学院上海生物科学研究所细胞库｡

1.1.2试剂SIRT4､β-actin单克隆抗体,50μL(上海江莱生物科技有限公司,中国);miRNC､miR-195-5pinhibitor､pcDNA3.1NC和pcDNA3.1SIRT4,纯度>96.2%(北京博奥森生物技术有限公司,中国)｡1.1.3仪器UVITEC凝胶成像分析系统FirReaderV10(英国UVITEC科技有限公司);二氧化碳培养箱150i(美国赛默飞公司)｡

1.2方法

1.2.1细胞培养与分组将不同类型细胞培养在含8%胎牛血清的培养基｡当HEC-1A细胞生长至对数生长期时,将HEC-1A细胞分为4组:miRNC实验组､miR-195-5pinhibitor实验组､pcDNA3.1NC实验组､pcDNA3.1SIRT4实验组｡

1.2.2细胞转染上述4组HEC-1A细胞生长至培养皿底部75%时,根据转染试剂脂质体3000说明书,将5μg的miRNC､miR-195-5pinhibitor､pcD-NA3.1NC以及pcDNA3.1SIRT4转染至对应实验组的HEC-1A细胞｡各组HEC-1A细胞处理48h后开展后续研究｡

1.2.3实时荧光定量PCR使用TRIzol试剂从各组细胞中分离总RNA｡通过逆转录酶试剂盒将总RNA逆转录为cDNA｡采用SYBRGreenMix在ABI7500快速实时PCR系统中进行qRT-PCR检测基因的表达｡β-actin与snRNAU6作为内源性对照,用相对定量2-△△CT法计算目的基因的表达水平｡本研究所用引物序列:SIRT4:上游引物GAGATCTGATA-CAATTCCCAGAC,下游引物CACCAUAGCCTC-GAGCAGA｡β-actin:上游引物GCTCATGCCTTGAT-GTAACGGCC;下游引物AGCGTCTCCGAACTGCT-GTGAC｡miR-195-5p:上游引物CTTTCGTGGA-GACCCCCTAAC,下游引物GAGGTAAGTCCGGT-GCAGTT｡snRNAU6:上游引物ATGGTGGATAAG-GTGCAAGTCC,下游引物GTCCAAGCTAACAGGCTTGTGA｡

1.2.4MTT实验分析HEC-1A细胞增殖活性各组HEC-1A细胞转染结束后,将HEC-1A细胞接种于96孔板｡分别于培养12､24､36h后,每孔加入10μL的MTT溶液,继续培养4h后,加入二甲基亚砜处理20min｡随后通过酶标仪在490nm波长下测定细胞吸光度值｡

1.2.5Transwell分析HEC-1A细胞的侵袭能力各组HEC-1A细胞转染结束后,将HEC-1A细胞悬浮在无血清RPMI-1640培养基中的细胞接种到Tran-swell小室的上腔室｡下腔采用RPMI-1640培养基,并添加20%胎牛血清血清｡孵育48h后,结晶紫染色｡观察和计数侵袭的细胞数量｡

1.2.6划痕实验分析细胞的迁移能力各组HEC1A细胞转染结束后,将HEC-1A细胞以每孔5×104个细胞的数量置于6孔板中培养至100%融合｡用无菌200μL移液管尖端划痕｡在无血清培养基中培养0､24h后,通过细胞划痕的面积变化计算各组HEC1A细胞的迁移率｡

1.2.7miR-195-5p与SIRT4的靶向关系通过Taregetscan对miR-195-5p与SIRT4间的结合域进行预测｡将含有miR-195-5p结合位点的野生型(Wildtype,WT)和含有miR-195-5p突变位点的突变型(Mutationtype,MUT)的SIRT4序列分别克隆到pGL3载体构建SIRT4-WT和SIRT4-MUT载体｡然后,使用脂质体3000将这些重组载体和miR-195-5p或miR-NC共转染至细胞｡24h后用裂解液处理各实验组细胞,随后上机检测各实验组荧光素酶活性｡

1.3观察指标(1)分析miR-195-5p与SIRT4在不同细胞中的表达;(2)观察miR-195-5p与SIRT4对HEC-1A细胞增殖活性､侵袭能力及迁移能力的影响;(3)分析HEC-1A细胞中miR-195-5p与SIRT4靶向关系｡

1.4统计学处理采用SPSS23.0软件进行统计分析,计数资料以x±s表示,采用Tukey事后检验的单因素方差分析评估多个实验组间的差异,studentt检验评估两个实验组间的差异,P<0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

2.1miR-195-5p与SIRT4在不同细胞中的表达HEC-1A细胞､Ishikawa细胞及MFE-296细胞的miR-195-5p表达高于ECS细胞;HEC-1A细胞､Ishikawa细胞及MFE-296细胞的SIRT4mRNA表达低于ECS细胞,差异均有统计学意义(P<0.01)｡说明miR-195-5p在人正常子宫内膜上皮细胞株中低表达,而在子宫内膜癌细胞中高表达;SIRT4在人正常子宫内膜上皮细胞株中高表达,而在子宫内膜癌细胞中低表达,见表1｡

表1miR-195-5p与SIRT4在不同细胞中的表达(x±s)

2.2miR-195-5p与SIRT4对HEC-1A细胞增殖活性的影响培养12h,miR-195-5pinhibitor实验组与miRNC实验组,pcDNA3.1SIRT4实验组与pcD-NA3.1NC实验组的HEC-1A细胞的增殖能力比较,差异均无统计学意义(P>0.05);培养24､36h,miR195-5pinhibitor实验组的HEC-1A细胞的增殖能力低于miRNC实验组,pcDNA3.1SIRT4实验组的HEC-1A细胞的增殖能力低于pcDNA3.1NC实验组,差异均有统计学意义(P<0.05),见表2｡

表2miR-195-5p与SIRT4对HEC-1A细胞增殖活性的影响(x±s)

2.3miR-195-5p与SIRT4对HEC-1A细胞侵袭能力的影响miR-195-5pinhibitor实验组的HEC-1A细胞的侵袭数低于miRNC实验组,pcDNA3.1SIRT4实验组的HEC-1A细胞的侵袭数低于pcDNA3.1NC实验组,差异均有统计学意义(P<0.05)｡

2.4miR-195-5p与SIRT4对HEC-1A细胞迁移能力的影响miR-195-5pinhibitor实验组的HEC-1A细胞的迁移率低于miRNC实验组,pcDNA3.1SIRT4实验组的HEC-1A细胞的迁移率低于pcDNA3.1NC实验组,差异均有统计学意义(P<0.05)｡

2.5HEC-1A细胞中miR-195-5p与SIRT4靶向关系通过Taregetscan预测miR-195-5p与SIRT4的结合位点,在SIRT4-WT实验组中转染miR-195-5pmimic后荧光素酶活性低于miRNC实验组,差异有统计学意义(P<0.05)｡

3、讨论

miRNA表达紊乱可导致多种疾病,如肿瘤细胞的恶性增殖是肿瘤进展的重要原因之一｡越来越多的证据表明,miRNA与细胞增殖､侵袭､迁移密切相关｡既往研究表明,miR-195-5p的表达失调可促进多种肿瘤的进展｡此外,相关研究证实miR-195-5p在子宫内膜癌细胞中上调[5],调节子宫内膜癌细胞的转移活性｡并且根据GEO数据库分析显示,miR195-5p在子宫内膜癌患者外周血的差异表达miR-NA中,miR-195-5p上调的最为明显｡本研究实验结果显示miR-195-5p在子宫内膜癌细胞株HEC-1A细胞､Ishikawa细胞､MFE-296细胞多种癌细胞中明显升高｡此外,抑制miR-195-5p表达后,HEC-1A细胞增殖､侵袭､迁移能力下降｡以上结果提示,miR195-5p与子宫内膜癌的转移能力密切相关｡因此,深入研究miR-195-5p影响子宫内膜癌生物学行为的机制具有重要意义｡

相关研究发现,SIRT4与肿瘤进展密切相关[6-8]｡SIRT4在前列腺癌组织和细胞中的表达明显降低,SIRT4可以通过抑制谷氨酰胺代谢影响前列腺癌细胞的增殖､迁移､侵袭能力和细胞周期[3]｡另外,有研究表明,SIRT4在膀胱癌的蛋白水平降低,较低的SIRT4水平与膀胱癌患者较大的肿瘤体积､较晚的肿瘤分期和较晚的病理分期相关,并且从机制上讲,SIRT4通过抑制自噬流来抑制膀胱癌的生长[4]｡本研究发现,SIRT4在子宫内膜癌细胞株HEC-1A细胞､Ishikawa细胞､MFE-296细胞多种癌细胞中明显降低,上调SIRT4表达后,HEC-1A细胞的活性减弱｡此外,本研究通过对miR-195-5p的下游靶点进行预测,发现SIRT4与miR-195-5p之间存在相互结合位点,并且miR-195-5p能够靶向抑制SIRT4的表达｡上述结果提示,miR-195-5p对子宫内膜癌进展的影响与靶向调控SIRT4密切相关｡

综上所述,本研究发现miR-195-5p在子宫内膜癌细胞中高表达,而SIRT4在子宫内膜癌细胞中低表达,且miR-195-5p能够抑制子宫内膜癌细胞的体内外增殖､迁移及侵袭,并且这一作用与miR-195-5p调控SIRT4的表达密切相关｡因此,miR-195-5p/SIRT4可能是治疗子宫内膜癌的新靶点｡

参考文献:

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[5]张正宇,杨倩,葛恒琳,等.基于H19/miR-195-5p/SGK1通路分析金银花提取物对子宫内膜癌术后感染大鼠的干预效果[J].中华医院感染学杂志,2024,34(11):1725-1729.

[7]王旭华,陈兆元,周华强,等.沉默信息调节因子4表达与肿瘤患者预后和临床特征关系的Meta分析[J].癌症进展,2023,21(15):1642-1645,1675.

基金资助:赤峰市自然科学科研课题(SZR24115);

文章来源:黄旭艳,董立娜,汤忠玉,等.miR-195-5p调控SIRT4对子宫内膜癌细胞的影响[J].中国城乡企业卫生,2025,40(05):4-7.