子宫内膜癌是一种发生于子宫内膜的一种上皮性恶性肿瘤，是女性常见的生殖器官恶性肿瘤之一，仅次于乳腺癌、肺癌和结直肠癌[1,2,3]。目前子宫内膜癌的发病机制主要与肥胖、代谢综合征、糖尿病、多囊卵巢综合征等能导致高雌激素状态引起的子宫内膜增生有关[4,5,6]。子宫内膜癌的治疗方法主要以手术切除子宫和双侧输卵管，卵巢为主，对于未生育的早期子宫内膜癌患者，通常采用高剂量孕激素保守治疗以实现保留生育功能的目的[7,8]。对于晚期患者，手术前要通过化疗缩小肿瘤体积，期间常使用孕激素、促性腺激素释放激素类似物等激素类药物和铂类、紫杉醇等化疗药物[9,10,11]。但子宫内膜癌患者预后并不理想，化疗不敏感性或耐药性的情况也时有发生，随着肿瘤发病机制的深入研究，越来越多的靶点被证实与子宫内膜癌有关，也出现了对应的靶向药物[12,13]。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor erb B1,EGFR）常常在子宫内膜癌中过度表达，有研究表明，EGFR在子宫内膜癌分化程度，肌层浸润深度等的判断具有重要意义，同时EGFR也是其他补益类中药或药效成分治疗子宫内膜癌的直接靶蛋白之一，故提示EGFR可能是补骨脂防治子宫内膜癌的关键靶蛋白[14,15,16]。

补骨脂是豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实，具有补肾壮阳、温脾止泻、纳气平喘的功效，临床上具有良好的抗肿瘤作用，其作用机制可能与抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞转移、抑制肿瘤血管内皮生成和逆转多药耐药有关[17,18,19]。有研究表明，补骨脂可作为雌激素受体的激动剂，作用于拥有雌激素受体的靶器官，如骨骼、生殖系统等，发挥雌激素样作用[20,21,22]。因此，补骨脂对雌激素的调节作用使其可用于子宫内膜癌的早期治疗，然而补骨脂治疗子宫内膜癌的活性成分及作用机制尚未得到深入研究。

亲和超滤-液质联用法是一种能够实现快速药物筛选的分析方法，亲和超滤法首先利用靶蛋白实现中药特异性配体成分的高通量筛选，再结合超高液相色谱-四级杆飞行质谱联用技术（ultraperformance liquid chromatography quadrupole timeof-flight mass spectrometry,UPLC-Q-TOF/MS）对筛选出的化合物进行定性和定量分析，从而实现对活性成分的快速鉴定，相较于传统分析方法，该方法具有操作简便、检测灵敏，结果特异等特点[23,24,25]。因此本研究以EGFR为靶蛋白，通过亲和超滤-液质联用技术筛选补骨脂治疗子宫内膜癌的活性成分，以期为进一步探究补骨脂治疗子宫内膜癌的作用机制奠定基础。

1、材料

1.1 药材

补骨脂（产地河南，批号20211203）购自北京同仁堂天津平山道大药房有限公司，经天津中医药大学胡静副教授鉴定为豆科植物补骨脂P.corylifolia L.的干燥成熟果实。

1.2 药品与试剂

对照品补骨脂素（质量分数>98%，批号RFS-B06502006015），补骨脂二氢黄酮甲醚（质量分数>98%，批号RFS-B07611804026）均购自成都瑞芬思德丹生物科技有限公司。EGFR（批号1541-226TF1-16Q）购自北京百普赛斯生物科技股份有限公司；蒸馏水购自广州屈臣氏食品饮料有限公司；乙腈和乙酸均为色谱纯，乙腈购自美国EMD Millipore公司，乙酸购自美国ROE公司；0.01%磷酸盐缓冲液（分析级）购自上海麦克林生化科技有限公司。

1.3 仪器

TGL-20M台式高速冷冻离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）；Waters ACQUITY UPLC液相色谱仪、Waters Xevo G2 QTOF质谱仪、ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm,1.7μm，美国Waters公司）；BT125D型十万分之一电子分析天平（德国Satorius公司）；YM-10型超滤离心管（美国GE Healthcare公司）。

2、方法

2.1 补骨脂提取液的制备

依据本课题组已发表的补骨脂成分鉴定方法[26]，准确称取5.0 g补骨脂置于圆底烧瓶，分别用50 m L和40 m L的蒸馏水加热提取2次，每次1 h。回流提取后合并滤液，并减压浓缩至50 m L，以12 000r/min离心5 min，得到质量浓度为0.1 g/m L的补骨脂提取液，0.22µm滤膜滤过，待用。

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称取补骨脂素与补骨脂二氢黄酮甲醚各5mg，加入蒸馏水配制成质量浓度0.05 mg/m L的混合对照品溶液。

2.3 EGFR蛋白样品的制备

将45μg EGFR溶于450μL PBS缓冲液（0.01mol/L,p H 7.4）并使其混合均匀，制备质量浓度为100μg/m L的EGFR活性蛋白液。另取100μg/m L的EGFR蛋白液100μL置于1.5 m L离心管中，100℃水浴加热30 min使其失活，作为变性对照组以排除蛋白对成分的非特异性吸附。

2.4 亲和靶蛋白活性成分的筛选

依据本课题组已发表的亲和超滤实验方法[27]，取50µL补骨脂提取液（0.1 g/m L),100µL EGFR蛋白溶液（100μg/m L）和50µL PBS缓冲液置于1.5m L离心管中（总体积200µL),37℃共孵30 min。将孵育后的样品转移至YM-10超滤离心管中，室温下12 000 r/min离心15 min，离心结束后加入100µL PBS缓冲液离心清洗3次，以去除未结合的游离成分。将洗涤液倒出后，向超滤离心管中加入100µL作为解离剂的50%甲醇-水溶液，室温下静置反应10 min。随后室温下12 000 r/min离心15 min，重复2次后，收集洗脱液，以释放出与EGFR结合的补骨脂潜在活性成分。亲和超滤-液质联用技术的实验流程如图1所示。为考察提取液和EGFR蛋白的相互作用强度，设置了蛋白变性对照组，蛋白变性对照组的操作过程同上。

图1 亲和超滤-液质联用技术的实验流程

2.5 UPLC-Q-TOF/MS分析潜在活性成分

利用UPLC-Q-TOF/MS液质联用技术对补骨脂提取液和超滤后结合的化学成分进行鉴定分析。采用前期实验室已建立的补骨脂成分分析条件[26]进行研究。

2.5.1 色谱条件

采用Waters ACQUITY UPLC(Waters公司，美国）进行分析，所用的色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm,1.7μm,Waters公司）。进样量5μL；体积流量0.3 m L/min；柱温45℃；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～1 min,1%～10%B;1～3 min,10%～18%B;3～7 min,18%～20%B;7～9 min,20%～46%B;9～13 min,46%～54%B;13～17 min,54%～58%B;17～20 min,58%～65%B;20～23 min,65%～75%B;23～25min,75%～100%B;25～27 min,100%B;27～28min,100%～1%B;28～30 min,1%B。

2.5.2 质谱条件

Waters Xevo G2 Q-TOF/MS质谱仪采用电喷雾离子源，在正离子模式下进行检测分析，毛细管电离电压为2.0 k V，去溶剂气体流速800L/h，去溶剂气温度450℃，测量扫描时间0.2 s，气体流量3 m L/min，碰撞能量20～40 e V，锥孔电压40 V，锥孔反吹氮气体积流量50 L/h，扫描范围m/z 50～1 500。

2.6 结合变化率的计算

根据亲和超滤的鉴定结果，利用补骨脂水提液与活性蛋白结合后化学成分的峰面积（Aa）、补骨脂水提液与失活蛋白结合后化学成分的峰面积（Ab）和补骨脂水提液中化学成分的峰面积（Ac），计算活性成分与EGFR的结合变化率。

3、结果

3.1 补骨脂提取液成分鉴定

基于Mass Lynx 4.1(Version 4.1,Waters，美国）软件对在UPLC-Q-TOF-MS正离子模式下的补骨脂水提液的分子离子峰进行化学成分的鉴定，水提物的基峰色谱（base peak chromatogram,BPI）图如图2所示；使用补骨脂主要成分（补骨脂素和补骨脂二氢黄酮甲醚）的对照品配制混合对照品溶液进行测定，以实现对补骨脂中的化学成分的鉴定。通过将补骨脂提取液离子峰质谱信息与文献中碎片信息和对照品进行比对，共在补骨脂提取液中鉴定出19种化学成分，具体成分信息见表1所示。

3.2 亲和超滤-液质联用筛选亲和靶蛋白的补骨脂活性成分

取适量亲和超滤收集得到的活性成分混合溶液和蛋白变性对照组溶液，用此条件进样分析，利用Mass Lynx 4.1(Version 4.1,Waters，美国）软件对待测溶液的正离子模式下的BPI图进行提取（图3），基于补骨脂提取液中已经确定的化学成分，对活性成分混合溶液和蛋白变性对照组溶液BPI图中各色谱峰的相对分子质量、二级碎片信息对各个物质进行活性分子定性鉴定（表2），并记录各个物质峰面积。共筛选得到4个化学成分，分别是补骨脂素、psorachalcone A、补骨脂呋喃查耳酮和delta (1,3)-补骨脂酚，结构见图4。以上4种物质可能是补骨脂治疗子宫内膜癌的潜在活性成分。

3.3 EGFR蛋白亲和力的评价

通过比较补骨脂活性成分组和蛋白变性对照组超滤液中待测物的峰面积，利用结合变化率公式计算筛选出的4种活性成分与EGFR蛋白的结合变化率。结果表明，补骨脂活性成分在实验组中比蛋白变性组峰面积增大，psorachalcone A与EGFR蛋白结合变化率最大，为14.91%,4种活性成分与EGFR蛋白结合变化率的高低顺序依次为：psorachalcone A(14.91%)>delta (1,3)-补骨脂酚（9.39%）>补骨脂呋喃查耳酮（6.95%）>补骨脂素（2.59%）。

图2 UPLC-Q-TOF-MS正离子模式下补骨脂水提物的BPI图   

表1 正离子模式下补骨脂水提液UPLC-Q-TOF-MS成分分析  

图3 UPLC-Q-TOF-MS正离子模式下补骨脂活性成分(A)与蛋白变性对照组溶液(B)活性成分的BPI图   

4、讨论

EGFR蛋白是一种跨膜糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，已经在多种肿瘤中发现肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等生物学行为均与EGFR活化有关[28]。有研究证明，EGFR在子宫内膜癌中表达水平较正常子宫内膜组织明显升高，EGFR高表达与子宫内膜癌的分期、分化、分型和淋巴结转移相关，且患者较差的预后与EGFR的表达量呈正相关[29,30]。因此本实验以EGFR蛋白为靶点，通过亲和超滤-液质联用技术从补骨脂中快速筛选得到4种可以与EGFR蛋白特异性结合的化学成分。子宫内膜癌的发生与未拮抗的雌激素暴露有关，当暴露于未拮抗的雌激素时，即使是低水平的雌激素也可能导致不良的子宫内膜事件[31]。补骨脂素能够激活雌激素受体，加速雌激素与受体结合，减轻雌激素暴露，因此补骨脂素能够通过调节体内雌激素含量发挥对子宫内膜癌的治疗作用[32]。Ki67蛋白的高表达是细胞增殖的标志，与子宫内膜癌患者的低生存率有关[33]。有研究表明，补骨脂素可调控Ki67蛋白表达，从而抑制癌细胞增殖[34]。另外，补骨脂素还可以通过内质网应激途径诱导癌细胞凋亡，从而发挥治疗子宫内膜癌的作用[35]。综上所述，补骨脂素能够通过抑制癌细胞增殖和加速癌细胞凋亡，对子宫内膜癌起到较好的治疗作用。缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）是在缺氧的情况下诱导的一种转录因子，与肿瘤的发生、生长和转移等因素有关[36]。有研究表明补骨脂酚类化合物对HIF-1具有抑制作用，能够显著降低癌细胞的存活率，从而抑制子宫内膜癌的发展[37]。与正常内膜组织相比，促凋亡蛋白在子宫内膜癌组织中显著低表达，而抗凋亡蛋白在子宫内膜癌组织中高表达，这导致子宫内膜细胞凋亡和抗凋亡的失衡，即凋亡速度慢于增殖速度[38,39]。有实验研究证明，补骨脂酚类化合物能够增加促凋亡蛋白表达，降低抗凋亡蛋白表达，减小肿瘤细胞恶性程度，调节肿瘤细胞凋亡过程[40]。因此，推测补骨脂中的补骨脂酚类化合物delta (1,3)-补骨脂酚可能通过干预HIF-1和细胞凋亡相关蛋白的表达量，抑制子宫内膜癌的发生与发展。  

表2 活性成分混合溶液的UPLC-Q-TOF/MS成分分析 

图4 补骨脂活性成分的化学结构   

本实验也存在一些不足之处。首先，本实验基于亲和超滤-液质联用技术初步筛选了补骨脂中可以与EGFR特异性结合的活性成分，但这些化合物的生物活性及其结合位点还有待进一步验证，因此后期需要进一步利用表面等离子共振技术（surface plasmon resonance,SPR）对实验结果进行验证。其次，仍需在体内和体外水平上深入探索并揭示筛选出的补骨脂活性成分治疗子宫内膜癌的分子机制，以完善补骨脂的药效物质基础。

5、结论

本实验为探讨补骨脂对子宫内膜癌的治疗作用，以EGFR蛋白为发挥作用的关键靶点，利用亲和超滤-液质联用技术可以从复杂成分中快速筛选活性成分的特点，将补骨脂和EGFR蛋白共同孵育，利用超速离心和解离剂对活性配体进行分离和筛选，并设置对照组以考察活性成分对EGFR蛋白的相互作用强度。结合液质联用技术共筛选出4个与EGFR蛋白结合的活性成分，结合文献和对照品，判断4个化合物分别为补骨脂素、psorachalcone A、补骨脂呋喃查耳酮和delta (1,3)-补骨脂酚。本研究可以为补骨脂防治子宫内膜癌的物质基础和作用机制研究提供理论依据，但补骨脂活性成分与EGFR的结合位点和量效关系还需要进一步探究。

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基金资助:宁波市妇科疾病临床医学研究中心(2024L002); 天津市科技局重大专项与工程计划项目(21ZXJBSY00040);

文章来源:蒋本贵,陈思越,钱文秀,等.亲和超滤-液质联用技术筛选补骨脂治疗子宫内膜癌的有效成分[J].中草药,2024,55(14):4663-4669.