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GATA3介导miR-21/PTEN轴对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭的影响

2024-08-01 73 上传者：管理员

摘要：目的分析GATA结合蛋白3(GATA3)介导微小RNA-21(miR-21)/人类第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）轴对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭的影响。方法取HEC-1-A细胞，进行转染分组，分为对照组、GATA3空载质粒组、GATA3过表达质粒组、GATA3 siRNA阴性对照组、GATA3siRNA组。检测各组细胞中GATA3、miR-21、PTEN表达量、增殖情况、凋亡率、迁移、侵袭。结果与hEEC组相比，HEC-1-A组、HEC-1-B组、Ishikawa组细胞中GATA3、miR-21表达水平升高，PTEN表达水平降低（P <0.05）。与GATA3空载质粒组相比，GATA3过表达质粒组GATA3、miR-21 mRNA表达量、增殖率、迁移距离、侵袭细胞数、Vimentin水平升高，PTEN mRNA表达量、凋亡率、Caspase-9、Bax、E-cadherin水平降低（P <0.05）；与GATA3 siRNA阴性对照组相比，GATA3、miR-21 mRNA表达量、增殖率、迁移距离、侵袭细胞数、Vimentin水平降低，PTEN mRNA表达量、凋亡率、Caspase-9、Bax、E-cadherin水平升高（P <0.05）。结论下调GATA3表达，可对miR-21/PTEN轴进行调节，使HEC-1-A细胞的增殖减慢，促进HEC-1-A细胞的凋亡。

关键词：
GATA结合蛋白3
人类第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物
侵袭R735.2
子宫内膜癌
微小RNA-21
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子宫内膜癌的生物学特征为侵袭转移，临床发病率、病死率较高[1-3]。mi R-21为参与肿瘤进展的mi RNA，可促进肿瘤的发展，并可对PTEN的表达进行调控[4]。PTEN为抑癌基因，具有较强的脂质磷酸酶活性，PTEN表达下降后，可促进VEGF、MMP-9的表达，诱导恶性肿瘤的发展[5]。GATA3在T细胞淋巴瘤中表达升高，可对细胞的分化、增殖、凋亡过程进行调节，且在妇科恶性肿瘤诊断中具有重要的价值，并可用于患者预后的评价[6]。临床研究中关于GATA3与子宫内膜癌的相关研究较少，且鲜有研究分析GATA3调控mi R-21/PTEN轴对子宫内膜癌细胞的作用，基于此，本研究分析子宫内膜癌细胞增殖、侵袭的分子机制，为临床子宫内膜癌的治疗提供参考。

1、材料与方法

1.1主要试剂及仪器

人子宫内膜上皮细胞（h EEC）、人子宫内膜癌细胞（HEC-1-A、HEC-1-B、Ishikawa）购自上海酶研生物科技有限公司。DMEM完全培养液购自上海哈灵生物科技有限公司；四甲基偶氮唑盐（Tetramethylazo salt,MTT）、四甲基联苯胺（Tetramethyl benzidine,TMB）试剂盒购自广州誉嘉生物科技有限公司；培养箱购自北京华创智造科技有限公司；电化学发光试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司；全蛋白提取试剂盒购自上海梵态生物科技有限公司。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2细胞培养

在含有10%胎牛血清的DMEM培养箱中，放入h EEC、HEC-1-A、HEC-1-B、Ishikawa细胞，设置培养条件为95%N2、37℃5%CO2，密度达到80%左右后，进行重复传代操作。

1.3细胞分组与转染

取HEC-1-A细胞，进行转染分组，对照组为不做处理的HEC-1-A细胞，GATA3空载质粒组为HEC-1-A细胞转染空载体，GATA3过表达质粒组为HEC-1-A细胞转染GATA3模拟物，GATA3 si RNA阴性对照组为HEC-1-A细胞转染GATA3阴性对照，GATA3 si RNA组为HEC-1-A细胞转染GATA3抑制剂，分组后，继续对细胞培养，细胞融合度为80%后，进行转染，连续转染24 h。

1.4检测方法

1.4.1 GATA3、mi R-21、PTEN表达量检测

提取h EEC、HEC-1-A、HEC-1-B、Ishikawa细胞中RNA进行检测，测量相关浓度、纯度，并逆转录为c DNA，采用模板定量PCR仪进行扩增，采用RT-PCR测定GATA3、mi R-21、PTEN表达量，反应条件：95℃预变性2 min、95℃30 s、60℃30 s,72℃延伸30 s，进行40个循环，采用2-△△Ct方法计算出相对表达量。

1.4.2双荧光素酶报告试验

采用star Base网站，预测GATA3靶基因，结果显示，GATA3中含有与mi R-21互补核苷酸序列，将WT-GATA3、MUT-GATA3、mi R-NC、mi R-21转入HEC-1-A细胞，进行双荧光素酶检测。

1.4.3细胞增殖检测

采用MTT比色法检测增殖，将100 mg MTT粉剂加入20 m L PBS溶液中，混合至浓度5 mg/m L，保存于4℃，配制1×104/m L细胞悬液，加入6孔细胞培养板，每孔200µL，分别于24、48、72 h后倒弃培养液，取适量磷酸盐平衡盐水，对培养板进行冲洗，将20µL MTT溶液加入，室温下进行孵育，4 h后弃去培养液，将150µL DMSO加入孔中，避光下混匀，其结晶溶解后，采用酶标仪进行检测处理，490 mm波长下对培养孔的吸光度进行检测，计算细胞增殖率。

1.4.4细胞凋亡检测

收集各组细胞，使用PBS进行漂洗，重悬后以2 000 r/min离心处理5 min，弃去上层血清，将5µL Annexin V-FITC加入，摇匀后孵育20 min,200×g离心处理5 min，弃去上层血清，将10µL碘化丙啶加入，孵育1 h，后采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.4.5细胞迁移情况检测

采用划痕试验细胞检测迁移情况，取生成好HEC-1-A接种于6孔板，细胞融合铺开后，采用200µL枪头在孔板底部划线，保持均匀用力，采用PBS对孔板进行3次冲洗，将枪头划至脱落的细胞冲洗干净，在10%FBS培养基中，培养6孔板内HEC-1-A，使用倒置显微镜进行观察，取划痕宽度，角度一致，对细胞的爬行情况进行观察，拍照进行记录。

1.4.6细胞侵袭能力检测

采用Transwell实验检测细胞侵袭能力，将Matrigel基质胶放入4℃冰箱至液态，备用。使用无血清成分的培养基将Matrigel基质胶稀释，稀释比为8∶1，稀释后均匀涂抹于侵袭小室上室面，采用无血清DMEM培养基进行细胞培养，12 h，重悬，制备单细胞悬液，密度为1×105个/m L。在小室上室加入200µL单细胞悬液，在24孔细胞培养板中，加入500µL 10%FBS培养基，移动上室至孔内，继续培养48 h，后取出小室，放入烧杯，采用磷酸盐平衡盐水冲洗小室，采用棉棒擦去残余Matrigel基质胶，小室底层细胞，并使用4%多聚甲醛进行固定，15 min后，采用0.1%结晶紫进行染色，20 min进行2～3次的冲洗，并自然晾干，采用倒置显微镜进行观察，计算穿过小室的细胞数量。

1.4.7凋亡蛋白、EMT标志蛋白表达情况检测

采用Western blot法检测，细胞中加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂，制作组织匀浆，裂解后提取总蛋白，采用12%SDS-PAGE分离蛋白，使用PVDF膜进行湿法转膜，后使用5%脱脂牛奶进行封闭处理，室温下封闭2 h，加入Caspase-9、Bax、E-cadherin、Vimentin一抗，4℃下孵育24 h，后采用二抗孵育1 h，使用ECL化学发光剂进行显色处理，计算恢复值，以GAPDH为内参，对蛋白表达情况分析。

1.5统计学方法

采用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1子宫内膜癌细胞中GATA3、mi R-21、PTEN表达水平对比

与h EEC组相比，其余三组细胞中GATA3、mi R-21表达水平升高，PTEN表达水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1子宫内膜癌细胞中GATA3、mi R-21、PTEN表达水平对比

2.2各组HEC-1-A细胞GATA3、mi R-21、PTEN表达水平对比

与GATA3空载质粒组相比，GATA3过表达质粒组GATA3、mi R-21m RNA表达量升高，PTEN m RNA表达量降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与GATA3 si RNA阴性对照组相比，GATA3、mi R-21m RNA表达量降低，PTEN m RNA表达量升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2各组HEC-1-A细胞GATA3、mi R-21、PTEN表达水平对比

2.3 GATA3与mi R-21的靶向关系

双荧光素酶报告试验显示，与mi R-NC组相比，过表达mi R-21可使WT-GATA3荧光素酶活性升高（P<0.05），对MUT-GATA3荧光素酶活性影响较小（P>0.05）。见表3。

2.4各组HEC-1-A细胞增殖、凋亡情况对比

与GATA3空载质粒组相比，GATA3过表达质粒组增殖率升高，凋亡率减少，差异有统计学意义（P<0.05）；与GATA3 si RNA阴性对照组相比，GATA3 siRNA组增殖率减少，凋亡率升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

表3双荧光素酶报告试验

2.5各组HEC-1-A细胞迁移、侵袭情况对比

表4各组HEC-1-A细胞增殖、凋亡情况对比

Tab.4 Cell proliferation and apoptosis of HEC-1-A cells,in each group

与GATA3空载质粒组相比，GATA3过表达质粒组迁移距离、侵袭细胞数增加，差异有统计学意义（P<0.05）；与GATA3 si RNA阴性对照组相比，迁移距离、侵袭细胞数减少，差异有统计学意义（P<0.05）。见表5。

表5各组HEC-1-A细胞迁移、侵袭情况对比

2.6各组HEC-1-A细胞凋亡蛋白、EMT标志蛋白表达情况对比

与GATA3空载质粒组相比，GATA3过表达质粒组Caspase-9、Bax、E-cadherin水平降低，Vimentin水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与GATA3 si RNA阴性对照组相比，Caspase-9、Bax、E-cadherin水平升高，Vimentin水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1、表6。

图1 HEC-1-A细胞凋亡蛋白、EMT标志蛋白

3、讨论

子宫内膜癌为生殖道三大恶性肿瘤，发病率逐年升高，且临床发病机制尚未明确，其持续高雌激素刺激为子宫内膜癌发病的危险因素，癌基因的激活、抑癌基因的失活均可导致子宫内膜癌的发生[7-8]。临床诊断子宫内膜癌技术的发展，使子宫内膜癌检出率不断增加，但肿瘤患者仍有较高的转移、复发率，对女性生殖健康的影响较大[9-10]。

在尿路上皮癌、乳腺癌等多种肿瘤的发展中，GATA3表达水平较高，可降低患者的生存率，GATA3可介导细胞周期，使肾上腺皮质癌细胞的增殖速度加快，促进肿瘤的发展[11-12]。在乳腺、尿路上皮、T细胞亚群分化中，GATA3为重要的转录因子，有关研究[13]显示，GATA3在乳腺癌的发生发展中具有重要作用，GATA3表达缺失后，表明乳腺癌发生转移。临床对乳腺癌组织标本研究[14]显示，GATA3表达水平降低，表明患者肿瘤分期较高，预后较差，为乳腺癌肿瘤的抑制因子。有关研究[15]显示，GATA3可对肿瘤的进展进行调节，并调控肿瘤的转移，使膀胱癌细胞的迁移、浸润受到抑制。本研究显示，GATA3在子宫内膜癌细胞中表达水平升高，升高GATA3表达后，可使细胞的活力、增殖率增加，并使细胞的凋亡率下降，表明GATA3可介导子宫内膜癌细胞的增殖、凋亡，对GATA3表达进行抑制，可控制癌细胞增殖，减弱细胞的侵袭能力。

表6各组HEC-1-A细胞凋亡蛋白、EMT标志蛋白表达情况对比

PTEN为抑癌基因，可负性调节细胞内多种信号通路，促使恶性肿瘤的发展[16-17]。VEGF、MMP-9为PTEN下游基因，可诱导新生血管的形成，诱导肿瘤细胞迁移、侵袭。本研究显示，GATA3表达上调，可使HEC-1-A细胞中GATA3表达升高，增加mi R-21表达，使PTEN表达量降低，抑制GATA3表达后，可降低mi R-21表达，增加PTEN表达水平，使癌细胞的增殖能力受到抑制，加快细胞的凋亡，使细胞的转移、侵袭能力减弱。相关研究[18-20]显示，mi R-21在多种肿瘤中表达升高，可促使VEGF的表达，加快肿瘤的病理性进展，且检测VEGF表达水平，可对肿瘤的恶性程度、预后进行评估，mi R-21高表达于恶性肿瘤，可抑制抑癌基因PTEN的表达，使肿瘤的病理性进展加快。该研究与本研究基本一致，表明抑制mi R-21表达可促进癌细胞的电网，减弱癌细胞的转移、侵袭能力。

凋亡为细胞的死亡模式，主要特征为细胞膜起泡、核固缩、细胞皱缩、DNA片段化，细胞凋亡过程中，有多种基因蛋白参与调控，临床中细胞的凋亡的核心的调控分子为Caspase[21-22]。EMT在胚胎发育、组织重建中具有重要，E-cadherin为细胞角蛋白转化为Vimentin为主的细胞骨架，具有间充质细胞特征[23]。本研究显示，GATA3表达上调，可使HEC-1-A细胞中Caspase-9、Bax、E-cadherin水平降低，Vimentin水平升高，促进癌细胞的增殖，使细胞的活力增加，并对细胞的凋亡、转移、侵袭能力进行改善，表明GATA3水平变化可对子宫内膜癌细胞的增殖、凋亡、侵袭造成影响。相关学者研究显示，EMT可使上皮细胞失去极性，获得较高的迁移、侵袭、抗凋亡能力，Bax可与Bcl-2结合，形成异源二聚体，进而抑制抗凋亡的活性，使线粒体膜的完整性受到破坏，使其释放细胞色素C，诱导细胞发生凋亡，抑制mi R-21/PTEN轴的激活，减弱细胞的增殖、迁移能力，促进细胞的凋亡[24-25]。该研究与本研究基本一致，表明抑制GATA3表达，可降低细胞活力，改善细胞的转移、侵袭能力。

综上所述，GATA3、mi R-21在子宫内膜癌细胞中表达升高，GATA3可激活mi R-21的转录，进而抑制PTEN表达，促进HEC-1-A的增殖，降低GATA3表达，可抑制miR-21/PTEN轴的激活，调控HEC-1-A细胞的增殖、凋亡，延缓子宫内膜癌的发展。但是本研究样本量较少，且未进行相关动物实验，在之后的研究中，我们会扩充样本量，进行进一步实验研究。

参考文献:

[1]王赛凤,史蔚,谢咸晶. RNA结合基序5基因敲除子宫内膜癌细胞系及其作用研究[J].实用医学杂志,2022,38(10):1203-1207.

基金资助:海南省科协青年科技英才创新计划项目（编号：QCXM202018）；

文章来源:王发辉,邓青春,林佳佳,等.GATA3介导miR-21/PTEN轴对子宫内膜癌细胞增殖､侵袭的影响[J].实用医学杂志,2024,40(15):2069-2074.