首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 呼吸疾病论文 > 中老年肺炎论文 > 依托咪酯对肺部感染大鼠肺损伤、肺部血管发育及NLRP3表达影响

依托咪酯对肺部感染大鼠肺损伤、肺部血管发育及NLRP3表达影响

2024-08-26 48 上传者：管理员

摘要：目的探究依托咪酯(Eto)对肺部感染大鼠肺损伤、肺部血管发育及热蛋白结构域蛋白(NLRP)3表达的影响。方法将50只大鼠按照随机数字表法分为空白组(NC组)、PA所致肺部感染大鼠模型组(PA组)、PA组给予不同剂量Eto干预后的Eto L组、Eto M组、Eto H组，每组10只。苏木素-伊红(HE)染色检测肺组织病理学变化；测定肺微血管密度；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清及肺泡灌洗液中炎症因子水平；Western印迹法检测肺组织中Toll样受体(TLR)2、髓样分化因子(MyD)88、核转录因子(NF)-κB p65、NLRP3、胱天蛋白酶(caspase)-1蛋白表达。结果和NC组相比，PA组肺组织明显损伤；Eto L、M和H组肺组织得到明显改善，且随着剂量的增加肺组织改善越明显。PA组CD31阳性细胞平均积分光密度值、微血管密度明显低于NC组(P<0.05);Eto各组CD31阳性细胞平均积分光密度值、微血管密度明显高于PA组(P<0.05),且呈剂量依赖。和NC组相比，PA组血清和肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-8水平及肺组织中TLR2、MyD88、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1蛋白表达明显升高(P<0.05);和PA组相比，Eto各组以上指标明显降低，且呈明显剂量依赖(P<0.05)。结论 Eto可改善肺部感染大鼠肺损伤，其可能与增加肺组织微血管密度、抑制肺组织NLRP3炎症小体表达有关。

关键词：
依托咪酯
热蛋白结构域蛋白(NLRP)3
肺损伤
肺部感染
肺部血管发育
加入收藏

耐药菌株感染性疾病指的是细菌或其他微生物发生耐药性，导致常规抗生素无法有效治疗的感染，这种情况在临床中越来越常见，给治疗带来了困难[1]。铜绿假单胞菌(PA)是一种常见的革兰阴性杆菌，也是导致医院获得性肺炎的常见致病菌，其所致的慢性肺部感染较为严重，严重威胁人们的生命健康[2,3]。目前，由于PA耐药性较高，对于慢性肺部感染的治疗效果并不理想，导致大部分患者肺部感染迁延并侵袭气道。PA所致的慢性肺部感染的发生机制较为复杂，研究发现，PA可以通过调节脂多糖来激活Toll样受体(TLR)4信号传导通路，从而激活炎症反应，这种反应可能导致细胞因子的过度产生，进而引发组织损伤和炎症病变[4,5]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLR)是一类细胞内受体，参与调节免疫和炎症反应[6]。在NLR家族中，热蛋白结构域蛋白(NLRP)3炎症小体是目前研究最清楚的炎症小体，近年来研究发现，PA在胆囊纤维化患者的支气管上皮和巨噬细胞中NLRP3炎症小体均被激活[7],但NLRP3炎症小体对PA感染引起免疫调控并不清楚。依托咪酯(Eto)是临床常用短效麻醉药，有研究显示Eto可抑制肾上腺皮质功能，从而调控机体炎症反应，降低患者体内促炎因子水平，但其对PA所致的肺部感染作用尚不清楚[8]。因此，本研究旨在探究Eto对肺部感染大鼠肺损伤、肺部血管发育及NLRP3表达的影响。

1、材料与方法

1.1菌株

耐药PA临床分离株，样本号20PXSP1925,经北京中医药大学东直门医院细菌室进行菌株鉴定与药敏检测。

1.2实验动物

SPF级雄性SD大鼠50只，体质量200～220 g,均购自浙江省固定种动物育种中心，动物许可证号SYXK(浙)2020-0231。饲养条件：温度恒定23～26℃,相对湿度39%～44%,光照12 h/12 h昼夜交替，自由饮水进食，适应性喂养大鼠7 d。

1.3试剂和仪器

Eto(江苏恩华药业股份有限公司，国药准字：H20020511);3%戊巴比妥钠、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-8酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(武汉华美公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);兔抗大鼠TLR2、髓样分化因子(MyD)88、核转录因子(NF)-κB p65多抗(北京达科为生物技术有限公司);化学发光成像系统(上海金鹏分析仪器有限公司)。

1.4分组及模型制备

大鼠按照随机数字表法分为空白组(NC组)、PA所致肺部感染大鼠模型组(PA组)、PA组给予不同剂量Eto干预后的Eto L组、Eto M组、Eto H组，每组10只。PA组、Eto L、M、H组制备PA所致肺部感染大鼠模型，步骤为：大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉并固定，暴露声门裂，并由声门裂向气管内缓慢注入50μl1.1中菌株，滴注完毕后，直立大鼠，并轻轻左右旋转。NC组用生理盐水替代菌株注射于气管内，其余步骤和其他各组相同。72 h后各组分别处死2只大鼠，在接种经过研磨肺组织的琼脂培养基中发现PA菌落，各组均成功制备PA所致肺部感染大鼠模型。造模成功后，Eto L、M、H组分别经腹腔注射1.5、3.0、6.0 mg/kg的Eto干预，1次/d,共连续给药14 d; NC组、PA组腹腔注射等量生理盐水，1次/d,共连续给药14 d。

1.5标本采集与处理

药物干预结束后，抽取各组腹腔静脉血1 ml,静置2 h后，2 500 r/min离心10 min收集上层血清备用。麻醉大鼠取肺组织，并采集肺泡灌洗液，肺组织置于-20℃冰箱保存备用。

1.6苏木素-伊红(HE)染色检测大鼠肺组织病理学变化

取各组肺组织，10%中性缓冲甲醛溶液对组织进行固定24 h,冲洗后依次在梯度浓度的乙醇溶液中进行脱水，二甲苯渗透，将渗透后的组织标本放入熔化的蜡里，使其浸透均匀，然后放入组织处理机中进行包埋，将包埋好的组织块用切片机切成厚度为4～6μm的组织切片，并将切片放置在切片玻片上，将切片玻片放入烤箱中进行焙干，将焙干后的切片玻片放入去蜡剂中，去除切片上的蜡质，将脱蜡的切片玻片依次放入苏木素溶液及伊红溶液中染色，在染色完成后，将切片依次在梯度浓度的乙醇溶液中进行脱水，二甲苯渗透后，将切片用适当的封片剂覆盖，放置在显微镜下观察和评估组织学病变。

1.7肺微血管密度测定

取各组肺组织，10%中性缓冲甲醛溶液对组织进行固定24 h,将固定的肺组织标本进行脱水、透明化和包埋，然后用切片机切割成厚度为4～6μm的组织切片，并将切片放置在切片玻片上，将切片玻片放入CD31内皮细胞标志物的抗体溶液中，进行免疫组化染色，将染色后切片玻片放置在显微镜下，观察并确定内皮细胞标志物的染色区域，使用显微镜摄像系统或数字相机等设备，拍摄高质量的图像，以阳性细胞积分光密度值记为该肺组织标本中CD31含量，计算肺微血管密度。

1.8血清和肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-8水平

取离心后的上清液和肺泡灌洗液，检测肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-8水平，检测步骤严格按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.9 Western印迹法检测完肺组织中TLR2、MyD88、NF-κB p65、NLRP3、胱天蛋白酶(caspase)-1蛋白表达

取各组肺组织，冰上裂解，离心，取上清，用二氨基联苯胺(DAB)法检测上清液中蛋白浓度。电泳10 min后转膜。完成后，5%封闭液封闭聚偏氟乙烯(PVDF)膜1 h。分别加入一抗TLR2、MyD88、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1过夜，加入辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗，孵育2 h。用化学发光成像系统检测细胞PVDF膜并成像。

1.10统计学方法

采用SPSS26.0软件进行方差分析，两两比较方差齐采用LSD-t检验，方差不齐采用校正t检验。

2、结果

2.1各组肺组织病理学变化比较

NC组肺组织中肺泡结构清晰，无炎性细胞浸润；与NC组相比，PA组肺组织损伤严重，炎性细胞大量浸润，肺泡结构明显被破坏，有明显融合现象。Eto各组肺组织得到明显改善，中性粒细胞浸润明显减少，且随着剂量的增加肺组织改善越明显，见图1。

2.2各组血清及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-8水平比较

和NC组相比，PA组血清及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-8水平明显升高(P<0.05);和PA组相比，Eto各组血清及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-8水平明显降低(P<0.05),见表1。

2.3各组肺微血管密度比较

PA组CD31阳性细胞平均积分光密度值、微血管密度明显低于NC组(P<0.05);Eto各组CD31阳性细胞平均积分光密度值、微血管密度明显高于PA组(P<0.05),且呈剂量依赖性，见表2。

2.4各组肺组织中TLR2、MyD88、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1蛋白表达比较

PA组肺组织中TLR2、MyD88、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1蛋白表达明显高于NC组(P<0.05);和PA组相比，Eto各组肺组织中TLR2、MyD88、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1蛋白表达明显降低，且呈明显剂量依赖(P<0.05),见表2、图2。

图1各组肺组织病理学变化(HE染色，×200)

和NC组相比：1)P<0.05;和PA组相比：2)P<0.05;和Eto L组相比：3)P<0.05;和Eto M组相比：4)P<0.05;下表同

表1各组血清及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-8水平比较

表2各组CD31阳性细胞平均积分光密度值、微血管密度及肺组织中TLR2、MyD88、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1蛋白表达比较

图2各组肺组织中TLR2、MyD88、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1蛋白

3、讨论

肺部感染是PA最常见的感染之一，PA引起的肺部感染症状包括呼吸困难、咳嗽、痰液增多、发热等，严重感染还可能导致肺脓肿、脓胸等并发症，对患者的生命健康造成严重的威胁[9]。由于PA诱导的肺部感染患者预后较差，因此探究治疗该疾病的有效药物是目前临床研究的难点。Eto是临床上常见的一种镇静催眠药物，其具有起效快、副作用小等优点被临床麻醉诱导广泛应用。有研究发现，Eto具有时量相关半衰期较短的药代动力学特点，当给患者进行持续输注或多次给药后仍能快速清醒，因此可作为静脉麻醉药物用于麻醉维持期间[10,11]。目前临床应用Eto已有30年的历史，有研究显示[12],Eto对脂多糖诱导的感染性休克大鼠急性肺损伤具有保护作用，但目前关于Eto对PA诱导的肺部感染的作用尚未见报道，因此本研究制备PA诱导的慢性肺感染大鼠模型，通过病理学组织显示本实验成功制备大鼠模型，并通过给予PA模型大鼠Eto干预治疗，观察其对大鼠肺损伤、肺部血管发育和NLRP3表达的影响。研究显示[13],肺泡的正常发育和正常肺微血管形成密切相关。CD31是免疫球蛋白家族成员之一，其广泛表达于成熟个体的所有内皮细胞中，对内皮细胞的多种生物学活性具有调控作用，包括迁移、血管生成等，因此在临床上通常用于血管内皮细胞的标志物。CD31在肺组织中主要表达于肺微血管内皮细胞。有研究发现[14],肺部感染可导致肺部微血管不能正常发育。本研究结果提示，PA诱导的肺部感染大鼠肺组织有明显的损伤，肺微血管发育障碍；进一步研究发现，Eto可缓解PA诱导肺部炎症大鼠肺组织损伤，对肺组织微血管发育发挥促进作用。蓝国锋等[15]研究发现，可通过增加肺组织微血管密度来缓解大鼠肺组织病理学变化。研究发现[16],细胞因子和PA诱导的肺部感染密切相关。TNF-α是炎症早期最常见的炎性因子之一，其可激活单核巨噬细胞，进而释放TNF-α、IL-1等形成正反馈进一步释放促炎因子。IL-6能诱导T细胞分化、增殖，参与机体的免疫应答，是炎性反应的促发剂。IL-8能刺激T淋巴细胞趋化，通过损伤内皮细胞导致组织坏死，造成器官功能损伤。本研究结果提示，PA诱导的肺部炎症大鼠炎性水平升高；进一步研究发现，不同剂量的Eto均可抑制PA诱导的肺部感染大鼠炎性反应。姚伟等[17]研究证实，可通过抑制Eto慢性肺部感染大鼠肺部炎症反应保护肺组织。研究发现[18],外源性刺激均可激活NLRP3炎症小体，包括细菌和病毒等，他们会通过活化caspase-1而切割促进caspase-1活化，进一步切割TNF-α、IL-6、IL-8并使之成熟，最终导致炎症反应的发生。本研究结果进一步证实上述观点。研究发现，肺部感染后TLR2表达明显升高，且其可进一步加重感染反应，最终造成组织的浸润性损伤[19]。本研究结果显示，不同剂量的Eto对肺组织损伤发挥修复作用，可能是通过抑制TLR2信号通路而抑制炎症反应分泌有关。何谷良等[20]研究证实，可通过调节TLR2/MyD88信号通路相关蛋白表达的水平发挥流行病毒所致的肺部感染。

参考文献:

10胡远,陈立建.依托咪酯对脂多糖诱导Kupffer炎症反应及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3/白细胞介素-1β通路的影响[J].中国临床药理学杂志,2020;36(2):185-8.

11李曦,吴仲,代丽娜,等.依托咪酯对DNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎氧化应激和炎症因子表达的干预及机制研究[J].中国免疫学杂志,2021;37(23):2822-6,2831.

12王清兵,路超,于刚.基于TLR4通路依托咪酯对感染性休克大鼠急性肺损伤的保护作用研究[J].中国比较医学杂志,2021;31(11):42-7.

15蓝国锋,王艺瑾,黎云芳,等.布地奈德对宫内感染致支气管肺发育不良新生大鼠肺部血管发育及血管内皮生长因子,核苷酸结合寡聚化结构域样蛋白3表达的影响[J].中华实用儿科临床杂志,2021;36(2):128-31.

16张鸿,陈炜.铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统结构及调控机制的研究进展[J].中国感染与化疗杂志,2020;20(3):335-9.

17姚伟,陆溦,何杰,等.miR-146a靶向Toll样受体2通路对铜绿假单胞菌慢性肺部感染大鼠肺组织的保护作用[J].中华医院感染学杂志,2021;31(20):3105-9.

18黄碧,谢茜,覃直然,等.IFITM3调控流感病毒感染小鼠肺组织NLRP3炎症小体活化的研究[J].预防医学情报杂志,2022;38(6):844-51.

基金资助:山东省医药卫生科技发展计划项目(2017WS353);

文章来源:高顺翠,苏琳,张彦梅,等.依托咪酯对肺部感染大鼠肺损伤､肺部血管发育及NLRP3表达的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(16):3995-3999.