肾癌(renal cell carcinoma,RCC)是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤,1998─2008年,中国肿瘤登记地区RCC的死亡率总体呈增长趋势,年均增长死亡率为7.63%。随后,总体趋势趋于稳定。总的来说,中国肾细胞癌死亡率的增长男性略高于女性,城市地区低于农村地区[1]。

磷脂酰肌醇特异性磷脂酶Cε(phospholipase Cε,PLCε)是利用酵母双杂交筛选技术在线虫中发现的一种磷脂酶C的同工酶[2],除了拥有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(phospholipase C,PLC)家族成员共享的保守的x和y催化基序外,还包含一个扩展的N终端区域,这使它具有了其他磷脂酶所不具备的特殊功能,及可被H-ras癌基因的蛋白质表达产物(小G蛋白)和G蛋白双向调节[3,4]。已有实验证明,在泌尿系统肿瘤中,PLCε发挥一个致癌基因的作用。在前列腺癌中,PLCε通过PPARβ/twist1参与前列腺癌细胞的迁移和上皮–间充质转换(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程[5],并可以通过Wnt/β-catenin信号通路对比卡鲁胺耐药的前列腺癌的细胞增殖进行调控[6]。在膀胱癌细胞中,PLCε可以通过CDC25A影响T24细胞的瓦伯格效应[7],同时,对膀胱癌的EMT和迁移能力具有一定的促进作用[8]。在肾癌中,PLCε与促炎细胞因子的释放存在一定的相关性[9]。近年来,免疫疗法因其具有副作用小、预后良好的优势,在肾癌的治疗中得到重视。大剂量的白细胞介素-2(interleukin 2,IL-2)是最早使用的免疫疗法,其主要通过淋巴细胞发挥作用[10],但对肿瘤细胞的影响目前尚不明确。PLCε在肾癌中可以引起一定的免疫反应,但是否在IL-2治疗中发挥一定的作用,目前尚不清楚。本实验将使用sh-PLCε慢病毒敲减肾癌细胞株786-o中的PLCε,以此为基础来探讨PLCε在IL-2治疗中的作用。

1、材料与方法

1.1细胞株

人肾癌细胞株786-o和人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2购于中国科学院上海细胞库,保存于重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室。

1.2慢病毒

PLCε干扰慢病毒(LV-sh-PLCε)及通用阴性对照慢病毒(LV-shNC)由上海吉玛制药技术有限公司构建,序列信息见表1。

1.3主要试剂

细胞培养基RPMI-1640和胎牛血清购于Gibco公司;嘌呤霉素购于北京索莱宝科技有限公司;q-PCR引物由Invitrogen公司合成,引物信息见表2;RNA提取试剂盒Trizol、RT-PCR试剂盒和q-PCR试剂盒购于Ta Ka Ra公司;蛋白质提取试剂购于上海碧云天生物技术有限公司;山羊抗兔多克隆抗体、山羊抗鼠多克隆抗体购于杭州联科生物技术股份有限公司;兔抗人单克隆抗体(factor related apoptosis,Fas)、FADD、Caspase-3、C-Flip、Traf2和鼠抗人单克隆抗体Caspase-8购于Bioss生物技术公司;细胞因子IL-2购于Novoprotein科技有限公司;MTT试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司;ficoll试剂购于通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare Life Sciences);新鲜的健康成年人外周血由本课题组同学友情提供。

表1慢病毒序列

表2 PCR引物信息

1.4实验方法

1.4.1细胞培养

将肾癌细胞株786-o、人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2常规培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基,后置于37°C、5%CO2的湿度饱和培养箱中培养,待细胞贴壁且生长至80%～90%时,以0.25%胰酶消化并进行传代。

1.4.2转染sh-PLCε,筛选稳定细胞株

将肾癌细胞株786-o细胞消化后,接种于6孔板中(每孔5×104个)待细胞生长融合度达40%～60%,更换培养基,同时分别在其中两个孔中加入2μL Polybrene之后再分别加入5μL的LV-NC、LV-sh-PLCε病毒原液,置于37°C、5%CO2孵箱中孵育48 h后观察细胞状态和转染效率。细胞株感染病毒后继续传代3次,每次加1μg/m L嘌呤霉素进行筛选,获得786-o-sh-PLCε、786-o-sh NC稳定细胞株。

1.4.3 MTT检测IL-2处理细胞的最适浓度

在96孔板中每孔铺入200μL细胞悬液(细胞个数约为1 500个/孔),使用RPMI-1640完全培养基配制IL-2溶液,设置IL-2浓度梯度分别为0、5、10、15、20、25、30、35、40 ng/m L,使用含不同浓度IL-2的培养基培养细胞,放置于37°C、5%CO2孵箱分别培养24 h、48 h、72 h后,每孔加入10μL MTT试剂,37°C、5%CO2孵箱培养4 h终止培养,小心地将孔内上清完全吸出,弃去,每孔加100μL DMSO,37°C振荡10 min,使甲臜充分溶解(设置5个对照组,只加入DMSO用以排除试剂影响),490 nm处测量吸光度(D)值,并绘制生长曲线。

1.4.4实时定量PCR(q-PCR)

常规处理细胞72 h,待细胞生长至90%,用Trizol法提取细胞的总RNA,逆转录为c DNA后用SYBGreen法进行q-PCR(以β-actin为内参)。反应条件如下:95°C预变性3 min;95°C变性10 s,退火(温度因基因不同而不同)30 s;72°C延伸20 s;共40个循环(RT-PCR为30个循环)。

1.4.5 Western blot检测细胞中相关蛋白质水平

37°C、5%CO2条件下培养细胞72 h后,热裂解法提取总蛋白质,BCA法测定蛋白质浓度。用10%十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsμLfatepolyacrylamide-electrophoresis,SDS-PAGE)分离样品;湿转法转至聚偏氟乙稀(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜;5%脱脂奶粉在室温封闭2 h,一抗4°C孵育过夜,TBST洗涤5次;辣根过氧化物酶(horse-radish peroxidase,HRP)标记的二抗室温孵育2 h;TBST洗涤5次,ECL化学发光,显影分析。

1.4.6肿瘤细胞与淋巴细胞共培养

使用ficoll法提取健康成年人外周血淋巴细胞,与肿瘤细胞一起铺于6孔板中进行接触性共培养,72 h后,洗去悬浮的淋巴细胞,收集肿瘤细胞,流式细胞术检测共培养后肿瘤细胞凋亡情况。

1.4.7统计学分析

实验结果采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用t检验,P<0.05认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1肾癌细胞株786-o中PLCε呈现高表达状态

q-PCR和Western blot结果发现,与肾正常上皮细胞株HK-2对比,肾癌细胞株786-o中,PLCε表达呈过表达状态(P<0.01,图1)。

2.2转染sh-PLCε慢病毒下调786-o细胞中PLCε的表达

q-PCR和Western blot结果发现,无论是m RNA还是蛋白质水平,感染sh-PLCε慢病毒组的PLCε表达均低于NC组(P<0.01,图2);而空白对照组和NC组的PLCε表达差异无统计学意义(P>0.05,图2)。结果表明,转染sh-PLCε慢病毒成功下调786-o细胞内源性PLCε的表达,为后续实验奠定基础。

2.3转染sh-PLCε慢病毒后细胞凋亡水平增加

DAPI染色显示,与NC组相比,sh-PLCε组的细胞开始出现凋亡小体(图3);流式细胞术结果显示,NC组凋亡细胞比例为17.64%,sh-PLCε组凋亡细胞比例为25.27%,重复3次实验后分析2组凋亡比例差异水平,结果显示,二者具有统计学意义(P<0.05,图3)。两个实验结果均证明,敲减PLCε后,细胞的凋亡水平开始增加。

2.4敲减PLCε后,Fas/FasL表达水平下降

使用q-PCR和Western blot实验检测敲减PLCε后,Fas/FasL的表达水平,结果显示,无论是在蛋白水平还是m RNA水平,Fas、凋亡相关因子配体(fas ligand,FasL)表达水平均降低(**P<0.01,***P<0.001,图4),提示PLCε可能通过Fas/FasL途径来对肾癌细胞凋亡进行调控。

2.5敲减PLCε后,细胞凋亡信号增强,凋亡抑制信号减弱

使用q-PCR和Western blot实验检测敲减PLCε后,Fas/FasL途径的下游分子,包括接头蛋白FADD、凋亡相关的分子Caspase8、Caspase3以及凋亡抑制相关的分子cFlip、Traf2的表达水平。结果显示,无论是在蛋白水平还是mRNA水平,接头蛋白FADD表达差异无统计学意义(P>0.05,图5),凋亡相关分子Caspase8、Caspase3表达增高(P<0.01和P<0.001,图5);凋亡抑制相关的分子cFlip、Traf2表达减低(P<0.01和P<0.001,图5),提示sh-PLCε可能通过增强凋亡信号通路,抑制凋亡抑制信号通路来促进肾癌细胞凋亡。

图1 HK-2与786-o细胞中PLCεmRNA以及蛋白表达水平

图2转染sh-PLCε慢病毒后,786-o细胞中PLCεmRNA以及蛋白表达水平

图3 786-o细胞NC组、sh-PLCε组细胞凋亡检测

2.6 MTT法检测IL-2处理细胞的最适条件

使用0、5、10、15、20、25、30、35和40 ng/mL,9个浓度的IL-2来处理786-o细胞。分别在24 h、48 h、72 h 3个时间点来检测细胞的存活率,结果显示,在25 ng/mL浓度,72 h处理细胞为IL-2处理细胞的最适条件(图6)。

2.7加入IL-2后Fas、Fasl表达增高

使用q-PCR和Western blot实验检测IL-2处理NC组、sh-PLCε组后,Fas、FasL的表达水平,结果显示,无论是在蛋白水平还是mRNA水平,Fas、FasL表达水平均增高(P<0.01,图7),提示IL-2可能会通过Fas/Fas L来影响细胞。

图4 786-o细胞中Fas、Fas L m RNA以及蛋白表达水平

2.8加入IL-2后,影响Fas/FasL下游分子的表达

使用q-PCR和Western blot实验检测IL-2处理NC组、sh-PLCε组后,Fas/Fas L途径的下游分子,包括接头蛋白FADD、凋亡相关的分子Caspase8、Caspase3以及凋亡抑制相关的分子c Flip、Traf2的表达水平,结果显示,无论是在蛋白水平还是m RNA水平,接头蛋白FADD表达水平增高(P<0.01,图8),凋亡相关分子Caspase8、Caspase3表达增高(P<0.01和P<0.001,图8);凋亡抑制相关的分子cFlip、Traf2表达减低(P<0.01和P<0.001,图8),方差分析sh-PLCε转染与IL-2处理2种处理因素对相关分子表达的影响,5个分子中,只有cFlip存在拮抗作用(P<0.05)。结果提示,IL-2可以通过促进Fas/FasL下游凋亡信号通路,抑制Fas/FasL下游凋亡抑制信号通路来调控肾癌细胞的凋亡情况,并且在cFlip分子的调控上,IL-2处理与shPLCε转染起拮抗作用。

图5 786-o细胞中FADD、caspase8、caspase3、cFlip、Traf2 mRNA以及蛋白表达水平

图6 MTT法检测IL-2处理细胞的最适条件

图7 IL-2处理后,786-o细胞中Fas、FasL mRNA以及蛋白表达水平

图8 IL-2处理后,786-o细胞中FADD、caspase8、caspase3、cFlip、Traf2 mRNA以及蛋白表达水平

2.9淋巴细胞与786-o细胞共培养后,细胞凋亡比例增加

Ficoll法提取健康成年人外周血的淋巴细胞,与786-o细胞进行共培养。流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡情况,结果显示,NC组凋亡细胞比例为21.92%,shPLCε组凋亡细胞比例为38.28%,加入IL-2后,NC组凋亡细胞比例为30.52%,sh-PLCε组凋亡细胞比例为62.64%(图9)。sh-PLCε转染和IL-2处理组的凋亡比例最高,对结果进行方差分析得,sh-PLCε转染和IL-2处理对细胞的凋亡影响存在协同作用(P<0.05)。进一步证明了转染sh-PLCε可以提高IL-2对肾癌的疗效。

3、讨论

凋亡相关因子Fas是一种定位于多种细胞表面的死亡受体(death receptor,DR),它可以触发凋亡信号转导通路,导致细胞凋亡[11,12]。Fas L是肿瘤坏死因子家族的一种细胞表面分子,与Fas受体结合,诱导Fas阳性细胞凋亡。Fas表达在多种细胞的细胞膜,而Fas L主要在活化的T细胞中表达。在免疫系统中,由活化的T淋巴细胞表达的FasL既可以诱导细胞介导的细胞毒性,也可能导致T淋巴细胞自身的凋亡性自杀[13,14],这取决于Fas下游启动的是凋亡信号通路,还是凋亡抑制信号通路[15,16,17,18,19]。外周T细胞的稳态主要由3种机制维持:T细胞无反应、调节性T细胞抑制和活化诱导的细胞死亡(activation induced cell death,AIDC)[20]。AICD是通过Fas介导的凋亡反复刺激TCR来控制效应T细胞群[21]。此外,AICD可以通过Fas和FasL之间的相互作用,诱导表达Fas和FasL的活化T细胞通过自杀或相互作用被杀死[22,23]。Fas/FasL介导的免疫调节具有双重特征,诱导有益或有害的影响,这与免疫紊乱的发生发展相关[24]。本课题证明,转染shPLCε可以抑制肾癌细胞株786-o细胞中Fas、FasL的表达,但在IL-2处理后,会逆转这种作用,奇怪的是,在二者联用组Fas、FasL的表达反而是最高的,这其中的机制通路目前尚不清楚,但流式细胞术显示,二者联用组的肿瘤细胞凋亡比例最高,这就说明,肿瘤细胞的Fas、FasL表达增高会增加肿瘤细胞自身的凋亡。

IL-2可以激活肿瘤特异性T细胞,并以此来抵抗肿瘤的发生发展已经成为一种有效的免疫疗法[10]。1985年,Rosenberg等[25]在向患者注射IL-2后观察到了侵袭性人类癌症的消退,这首次证明操纵人类免疫系统可重复导致肿瘤消退。自1992年起,美国食品药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)已陆续批准IL-2可用于治疗转移性肾癌和黑色素瘤,并在治疗肾癌[26]黑色素瘤的临床试验上取得了较好的结果[27],因此大剂量的IL-2治疗已成为临床上最早批准投入临床使用的免疫疗法之一,并具有较好的临床治疗效果[28,29]。但是IL-2治疗癌症存在剂量限制性的毒副反应[25],部分患者会出现钠水潴留,全身性毛细血管渗漏综合征等毒副反应。故如何减低大剂量IL-2治疗的毒副反应就成了目前所面临的主要问题,本课题研究证明,IL-2虽主要作用于淋巴细胞[10],但同时也会使肿瘤细胞相应的抗凋亡信号通路FasL/Fas/FADD/cFlip/Traf2激活,使细胞对IL-2的治疗产生一定的抵抗作用,这也许会是IL-2须使用较大剂量的原因之一,转染sh-PLCε则可以抑制此抗凋亡通路的激活,相反地,激活凋亡蛋白Caspase8,启动凋亡信号通路FasL/Fas/FADD/Caspase8Caspase3。故将转染sh-PLCε与IL-2联合使用,可以提高IL-2的治疗效果,为了证明我们的观点,我们将健康成年人外周血的淋巴细胞与肿瘤细胞进行了共培养,我们发现,二者连用组的肿瘤细胞凋亡比例最高,于是我们可以得出结论:sh-PLCε可以提高IL-2的治疗效果,进而可以达到减少使用剂量,降低IL-2毒副反应的目的。

图9流式细胞术检测细胞凋亡

综上所述,本实验揭示了敲减PLCε可以通过减少细胞的凋亡抑制,增强细胞凋亡信号的启动,来降低肾癌细胞对IL-2治疗的抵抗作用。这为改善IL-2临床使用的副反应,提高IL-2的疗效提供新的思路。

参考文献：

[1]韩苏军,王栋,寿建忠,李长岭,邢念增,张思维.跨世纪十年中国肾癌死亡趋势分析.癌症进展2019; 17(10):1143-6.

[5]范佳鑫,李罗,牛凌芳,范砚茹,高英英,吴小候,等. shPLCε通过PPARβ/twist1抑制前列腺癌细胞的迁移和EMT过程.中国细胞生物学学报2018; 40(05):665-74.

[6]李罗,范佳鑫,牛凌芳,范砚茹,高英英,张尧,等. PLCε沉默后通过Wnt/β-catenin信号通路抑制比卡鲁胺耐药的前列腺癌细胞增殖.肿瘤2018; 38(8):761-71+791.

[7]郝燕妮,李婷,范佳鑫,李罗,牛凌芳,欧俐苹,等. shPLCε通过下调CDC25A抑制T24细胞的瓦伯格效应.中国生物工程杂志2018; 38(5):33-9.

[8]赵燕,郝燕妮,刘南京,李婷,吴小候,罗春丽. miR-145通过下调PLCε抑制膀胱癌EMT和迁移及其机制研究.中国生物工程杂志2017; 37(3)27-36.

杨锦潇,段李梅,范佳鑫,李婷,范砚茹,袁鸿玲,吴小侯,罗春丽.Sh-PLCε提高IL-2治疗肾癌疗效的研究[J].中国细胞生物学学报,2019,41(12):2351-2359.

基金:国家自然科学基金(批准号:81072086)资助的课题