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PTGS2调控细胞增殖及抗氧化能力影响结肠癌患者预后

2024-10-31 302 上传者：管理员

摘要：目的基于前列腺素内过氧化物合成酶2（PTGS2）在结肠癌中的表达及预后分析，探讨并验证PTGS2影响结肠癌患者预后的潜在分子机制。方法从TCGA、HPA、UALCAN等数据库收集泛癌的转录组和蛋白质组学数据，并结合肿瘤患者的分期分型、生存时间等临床数据，分析PTGS2基因的表达模式和预后价值。基于基因集合富集分析（GSEA）鉴定在PTGS2高表达患者中显著激活的生物学功能，并以结肠癌细胞系SW480为例，进行体外验证。构建PTGS2过表达细胞株，使用CCK8法测定对细胞增殖的影响；使用不同浓度H2O2形成梯度氧化胁迫，检测细胞抗氧化能力的变化；并通过蛋白质免疫印迹初步验证其调控机制。结果 PTGS2的转录水平和表达水平在结肠癌患者中均显著上调（P<0.05）,且PTGS2的表达升高与患者的死亡风险升高相关（P<0.05）。数据分析和体外实验表明过表达PTGS2可能通过激活mTOR通路促进结肠癌细胞增殖；并通过上调氧化应激调控蛋白SOD2、NRF2调控细胞抗氧化能力。结论 PTGS2是一个潜在的结肠癌危险因素，其表达水平升高促进细胞增殖，增强细胞抗氧化能力，并与结肠癌患者不良预后相关。

关键词：
PTGS2
前列腺素内过氧化物合成酶2
抗氧化能力
泛癌
结肠癌
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环氧合酶(cyclooxygenase, COX)也称为前列腺素内过氧化物合成酶(prostaglandin-endoperoxide synthase, PTGS),是催化花生四烯酸合成前列腺素及其衍生物的限速酶，在细胞增殖、凋亡、炎性反应等过程中发挥作用[1]。该酶具有两种形式：COX1是组成型的，由PTGS1编码，参与维持生理稳态；COX2是诱导型的，由PTGS2编码，在正常组织中通常表达水平较低，但炎性反应、损伤或其他病理刺激下会诱导其过度表达[2]。研究表明，在许多类型的肿瘤中PTGS2的过度表达与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移有关[3]。COX2选择性抑制剂可以减少前列素E2的产生，用于治疗炎性反应和疼痛，并具有更低的肾脏和胃肠道毒性，是一类理想的非甾体抗炎药物[4]。塞来昔布(celecoxib)作为一种COX2选择性抑制剂，其临床前和临床研究都显示了其在肿瘤治疗和预防中的积极作用，但其抗肿瘤机制仍未得到充分研究[5]。

结直肠癌作为全球范围内发病率和病死率极高的恶性肿瘤之一，是美国癌死亡的第二大常见原因，也是中国第二大高发恶性肿瘤。根据2023年的美国癌症协会统计数据，尽管很大一部分结直肠癌死亡可以通过筛查来预防，病死率在总体上持续下降，但其发病率的下降在减缓，其诊断正在迅速转向更年轻、更晚期和左侧结直肠，提示了未知病因的潜在疾病风险，需要进一步的研究阐明结直肠癌的发病机制[6]。

因此，本研究结合生物信息学和细胞实验验证分析，尝试探索PTGS2过表达影响结肠癌患者预后的调控机制。TCGA分析表明，在结肠癌(colon adenocarcinoma, COAD)组织中，PTGS2表达升高且与患者不良预后相关。通过在结肠癌细胞系SW480中过表达PTGS2,探讨其表达水平对于细胞增殖能力和氧化应激耐受能力的影响，为COAD的临床治疗提供理论基础。

1、材料与方法

1.1 材料及试剂

结肠癌细胞系SW480(ATCC);RP1640培养基、胎牛血清、细胞用胰蛋白酶(Wisent公司); Polybrene感染试剂(Sigma-Aldrich公司);RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液、BCA(bicin-choninic acid)蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);CCK-8(cell counting kit-8)试剂盒[同仁化学研究所/东仁化学科技(上海)有限公司品牌/代理商];H2O2(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);Anti-COX2抗体、mTOR 信号通路检测试剂盒、anti-SOD2抗体、anti-4EBP1抗体、anti-p4EBP1抗体、anti-鼠二抗、Anti-兔二抗(Cell Signaling Technology公司);Anti-actin抗体(Vyzme公司)。

1.2 方法

1.2.1 PTGS2的泛癌及结肠癌表达分析：

从TCGA数据库下载33种肿瘤和正常组织的基因表达数据，以及患者的生存时间、无病进展时间、肿瘤分期、病理分型等临床数据，利用tcgaPlot、limma、clusterProfiler等R包进行差异分析、基因集合富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)、皮尔森相关分析及数据可视化。从HPA数据库[7]获得PTGS2在肿瘤和正常组织中的蛋白表达水平以及免疫组织化学染色数据。从UALCAN数据库[8]检索PTGS2在肿瘤和正常组织中的标准化蛋白质表达水平。

1.2.2 PTGS2在结肠癌中的预后分析：

根据结肠癌(colon adenocarcinoma, COAD)患者的基因表达数据、总体生存时间和无进展生存时间，用限制性立方样条来分析PTGS2表达水平与死亡风险之间的关系，并计算风险比(hazzard ratio, HR)及非线性关系。

1.2.3 稳定过表达PTGS2的细胞株构建：

选取pLVX-IRES-ZsGreen 1慢病毒表达载体，在结肠癌细胞系SW480中过表达COX2蛋白。在细胞汇合度约30%加入适量慢病毒溶液和Polybrene感染试剂，8～12 h后更换完全培养基，继续培养72 h后可在镜下观察荧光及蛋白表达情况。使用BD Aria Ⅲ流式细胞仪分选阳性细胞株至96孔板中，挑选绿色荧光较强且均匀的细胞群扩大培养。并通过免疫印迹验证COX2的蛋白表达量。

1.2.4 细胞株蛋白质提取及表达量检测：

使用RIPA裂解液破碎细胞并提取总蛋白质，使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。取20 μg等量样本上样，并进行SDS-PAGE分离。按照说明书浓度配置抗体，孵育COX2等一抗和对应二抗，使用化学发光成像仪检测条带。

1.2.5 细胞生长测定实验：

将细胞均匀铺在96孔板中，每孔2×103～4×103个细胞。加入CCK-8试剂，37 ℃反应1.5 h后用酶标仪测量450 nm和630 nm波长的吸光度。铺板4 h后测定1次作为起始，之后每12 h或24 h测定一次细胞存活数目。

1.2.6 细胞氧化应激耐受性检测：

将细胞均匀铺在96孔板中，每孔8×103～1×104个细胞。24 h加入不同浓度梯度的H2O2作为氧化剂，反应12 h后使用CCK-8测定细胞存活数目。

1.3 统计学分析

数据采用GraphPad Prism9.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差

表示，组间差异比较采用独立样本t检验，P<0.05表示差异具有统计学显著性。

2、结果

2.1 PTGS2表达水平的泛癌分析

TCGA数据库收录了33种肿瘤组织和癌旁组织的转录组数据,分析表明，PTGS2的mRNA表达量在其中4种肿瘤中显著升高，包括COAD、食管癌 (ESCA)、头颈部鳞状细胞癌(HNSC)和胃腺癌(STAD);在10种肿瘤中显著降低，包括膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳腺浸润癌(BRCA)、肾嫌色细胞癌(KICH)、肾透明细胞癌(KIRC)、肾乳头状细胞癌(KIRP)、肝细胞癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺鳞癌(LUSC)、前列腺癌(PRAD)、子宫内膜癌(UCEC)(图1A)。临床蛋白质组学肿瘤分析联盟(CPTAC)的数据表明PTGS2在COAD、UCEC、胰腺腺癌(PAAD)、HNSC、成胶质细胞瘤(glioblastoma)中高表达(图1B);HPA数据表明COX-2主要在甲状腺癌、结直肠癌、胃癌中高表达(图1C)。此外，通过PTGS2转录水平与基因组异质性的关联分析，发现在COAD、PRAD、直肠腺癌(READ)、胸腺癌(THYM)、子宫肉瘤(UCS)中，PTGS2的转录水平与肿瘤突变负荷(TMB)显著相关(图1D);在BRCA、COAD、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBC)、PRAD、睾丸癌(TGCT)和UCEC中，PTGS2的转录水平与微卫星不稳定性(MSI)显著相关(图1E)。结合上述四种分析，PTGS2仅在COAD中转录和蛋白高表达，且与肿瘤基因组异质性相关，提示PTGS2参与结肠癌的发生。

2.2 PTGS2在结肠癌患者中表达升高且与不良预后相关

通过对TCGA-COAD转录组数据集(图2A),以及GEO数据库中收录的2个结直肠癌基因表达数据集(图2B)进行分析，PTGS2在结肠癌组织中的转录水平显著高于癌旁组织。CPTAC数据表明，PTGS2的标准化蛋白表达水平在肿瘤组织中显著更高(图2C)。此外，不同分期的结肠癌中，PTGS2的转录和蛋白水平均表现出显著差异(图2D);不同的病理亚型中，PTGS2在黏液腺癌中的转录和蛋白水平均显著上升(图2E)。HPA数据库中免疫组化染色数据也表明PTGS2在结肠癌组织中的表达水平高于正常组织(图2F)。死亡风险分析表明，随PTGS2表达量升高，患者的死亡风险先上升后下降。当PTGS2表达值在0.75和2.55之间时，总体生存HR大于1;当PTGS2表达值在1.03和2.55之间时，无进展生存HR大于1(图2G),提示PTGS2对于患者是一项危险因素。

图1 PTGS2在泛癌中的转录水平和蛋白水平分析

图2 PTGS2在结肠癌患者中的表达和预后分析

2.3 过表达PTGS2促进SW480细胞增殖

根据PTGS2表达水平，将TCGA-COAD患者分为两组。组间差异基因的GSEA表明，上皮细胞增殖和内皮细胞增殖相关功能在PTGS2高表达的患者中显著激活(图3A,B)。在结肠癌细胞系SW480中构建PTGS2过表达细胞株。通过CCK8法测定生长速率，发现PTGS2过表达细胞系生长速率显著增加(图3C)。PTGS2高表达患者中，基因MTOR、AKT3、PIK3CA的显著上调提示mTOR/AKT通路的激活(图3D)。对部分关键蛋白进行免疫印迹验证(图3E),且其转录水平与PTGS2呈现出显著相关性(图3F)。上述结果表明，PTGS2表达量上升，mTOR通路活化，调控下游转录翻译的起始从而帮助细胞增殖和生长。

2.4 过表达PTGS2促进SW480细胞的抗氧化能力

GSEA分析表明，氧化应激响应相关功能在PTGS2高表达的患者中显著激活(图4A)。利用不同浓度的H2O2对细胞形成梯度氧化胁迫，细胞存活率随H2O2浓度增加而下降，但PTGS2过表达细胞系的存活率均显著高于对照细胞(图4B)。高表达PTGS2的患者中，线粒体超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)和转录因子NFE2L2的显著上调，以及NFE2L2竞争底物KEAP1的显著下调，提示氧化应激耐受增加(图4C)。免疫印迹验证了其中关键分子的表达变化(图4D),且其转录水平与PTGS2的转录显著相关(图4E)。上述结果说明过表达PTGS2能一定程度增加SW480细胞抗氧化能力。

图3 过表达PTGS2和m TOR通路活化可促进SW480增殖

3、讨论

PTGS2是介导前列腺素合成的关键酶之一，通常由炎性反应刺激产生，并在约74%～78%的结直肠癌中由上皮细胞表达[9]。研究表明其高表达与患者较差的总生存期相关，其抑制剂对诊断后的结直肠癌患者生存可能产生积极影响[10]。但PTGS2过表达影响结肠癌患者预后的调控机制尚未阐明。本研究表明，PTGS2促进细胞增殖，mTOR通路发生激活，并通过上调氧化应激调控蛋白SOD2、NRF2提升肿瘤细胞抗氧化能力，进而影响患者预后。

图4 过表达PTGS2提升SW480细胞抗氧化能力

mTOR是一种经典的细胞生长和增殖调控分子，存在于两种不同的复合体中。mTORC1主要通过促进合成代谢来增强细胞增长，mTORC2主要通过激活AKT等分子促进细胞存活。活化的mTOR通过磷酸化激活下游靶蛋白S6K,促进延长因子1α的转录；并通过抑制4E-BP1释放转录起始因子4E,促进下游细胞周期蛋白起始转录，促进细胞生长。

多项研究表明，PTGS2过表达与肿瘤细胞的抗氧化能力有关。它能够氧化广谱不饱和脂肪酸，产生具有抗炎和抗氧化性能的氧化代谢物[11]。同时，这些分子可以激活转录因子Nrf2。它作为氧化应激调控关键蛋白，通常被KEAP1复合体泛素化修饰并降解，氧化应激条件会破坏复合物从而释放激活NRF2,让其进入细胞核启动下游多种抗氧化、抗炎性反应基因的表达，如超氧化物歧化酶(superoxid dismutase, SOD)等[12]。SOD2将线粒体产生的超氧自由基转化为氧气和过氧化氢，对于维持细胞内的氧化还原平衡至关重要。

但是肿瘤细胞抗氧化能力的提升对于肿瘤发展的影响是动态和复杂的，不同致癌阶段中肿瘤细胞的生长需求是变化的。一方面，通过增强抗氧化能力来适应和抵抗氧化应激，有助于肿瘤的存活和进展。如Nrf2通过上调磷酸戊糖途径中的代谢酶，促进NADPH产生和促进嘌呤合成，进而促进细胞增殖[13]。肿瘤细胞还可以通过调节NADPH产生来抵抗脱离细胞外基质过程中升高的氧化压力，实现肿瘤转移[14]。另一方面，抗氧化基因的功能阈值可能对应着矛盾的生物学功能，其过度激活可能会诱导细胞凋亡和衰老，减缓肿瘤的进程和转移[15]。

同时，本研究也存在一些局限性。PTGS2的表达升高以及与预后的关联，需要进一步在汉族人群中进行验证。PTGS2过表达细胞系的增殖与mTOR表达上调相关，但二者因果关系仍需要开展进一步实验进行探讨。

综上，本研究使用广泛数据库数据系统性地分析了PTGS2在泛癌中的作用，并结合实验验证，发现PTGS2表达水平升高促进结肠癌细胞增殖，增强细胞抗氧化能力，并与结肠癌患者不良预后相关。这一发现提示PTGS2是一个潜在的结肠癌危险因素，为以PTGS2为靶点的相关药物研究及临床应用提供了理论依据。

基金资助:北京市自然科学基金(7244392,7242106); 国家自然科

文章来源:贺旸知歌,姜旭,张志文,等.PTGS2调控细胞增殖及抗氧化能力影响结肠癌患者预后[J].基础医学与临床,2024,44(11):1522-1529.